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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆，连接转化能长菌落，但是菌液PCR鉴定没有结果
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我要睡觉

新虫 (小有名气)
连接转化没问题，pcr出了问题！如果pcr成功，就算目的片段没有连进去，也会有一条小片段。建议你提质粒后直接扩质粒，模板0.5/1.0/2.0

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31楼2016-11-07 22:06:48
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上官凤舞

新虫 (正式写手)
不考虑菌株污染吗？

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32楼2016-11-08 08:56:19
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bnblxg

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by lyzjc at 2016-10-13 19:46:39
谢谢各位回复。
经自己的不断重复摸索，成功连接了一个，并且成功测序。今天做的菌液PCR鉴定也成功扩增出阳性克隆，已送去测序。

1、克隆相关的试剂一个都没有更换。
2、怀疑连接时间不够，把连接时间增加到6h ...

楼主，你好！最近我也在做TA克隆，连接效率不高，几乎没有！在AMP平板上能长出蓝白斑，可白斑基本全是假阳性，求指导哈！
PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收纯化PCR产物，电泳检测条带单一，浓度为46ng/微升。
PCR产物和pUcm载体连接，连接体系是：PCR产物5微升，pUcm-T vector 1微升，Ligation Mix 6微升。25℃连接30min，使用的是水浴锅。
LB平板：20mg/ml的X-gal，1mol/L的IPTG，100mg/ml的AMP，培养过夜
质粒粗提：挑白斑于5mlLB液体培养基中（加5微升AMP），摇菌过夜，取菌液离心后加50微升水和等体积的酚氯仿混匀，离心，跑电泳，在电泳下看质粒的条带大小
失败了多次，一直没连接成功杨，求楼主指教哈！！！
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33楼2017-02-20 14:39:08
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lyzjc

银虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 彭江容 at 2016-11-07 20:56:29
同新人一枚，楼主你看我看看我的问题在哪里吧！我做的菌长出来了，做了菌液pcr，然后电泳检测，发现有特异性条带，但是测序后做序列比对差了很多，这是什么原因呢？谢谢！
...

菌液pcr只是一种前期检验方式，并不能说明你的菌就是你的目的序列，有可能是大小一致的非特异性扩增呢，所以，还是要以测序的结果为准。像你这种情况，我怀疑是引物特异性不好，建议更换扩增引物。
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zhaijc@foxmail.com
34楼2017-03-03 19:36:36
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lyzjc

银虫 (小有名气)
引用回帖:
33楼: Originally posted by bnblxg at 2017-02-20 14:39:08
楼主，你好！最近我也在做TA克隆，连接效率不高，几乎没有！在AMP平板上能长出蓝白斑，可白斑基本全是假阳性，求指导哈！
PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收纯化PCR产物，电泳检测条带单一，浓度为46ng/微 ...

1、“连接效率不高，几乎没有”这句话是什么意思？ 是平板长的蓝白斑很少么。
2、你的pcr产物加的量有点高，一定要注意载体和pcr产物的浓度比例，严格按照说明书操作，防止连接效率不高。
3、连接温度建议调到16℃，连接时间可以延长。
4、摇菌过夜之后，可以直接拿来做菌液PCR。没用过你说的方法进行质粒提取，建议使用商品化的试剂盒。
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zhaijc@foxmail.com
35楼2017-03-03 19:44:28
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HOTSTAR

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lyzjc at 2016-09-21 15:44:27
自己顶一下吧

又做了一次，加了对照组，对照组菌落铺满了平板，而实验组零星的菌落，摇菌中，祝我成功。

有具体的试验步骤和心得没 做了好几个 星期 啥都没有  心累啊
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36楼2017-03-18 10:53:03
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lyzjc

银虫 (小有名气)
引用回帖:
36楼: Originally posted by HOTSTAR at 2017-03-18 10:53:03
有具体的试验步骤和心得没 做了好几个 星期 啥都没有  心累啊...

实验步骤各个硕博论文上都有，心得的话你就看回帖记录吧
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zhaijc@foxmail.com
37楼2017-04-07 08:08:17
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上官尹悠

金虫 (职业作家)
引用回帖:
15楼: Originally posted by lyzjc at 2016-10-13 19:46:39
谢谢各位回复。
经自己的不断重复摸索，成功连接了一个，并且成功测序。今天做的菌液PCR鉴定也成功扩增出阳性克隆，已送去测序。

1、克隆相关的试剂一个都没有更换。
2、怀疑连接时间不够，把连接时间增加到6h ...

你们要连这么就啊

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努力，追求自己的追求！
38楼2017-04-07 08:36:39
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艾喵喵

木虫 (正式写手)
我最近也一直在做，但是不知道用高保真酶测序还有突变

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39楼2017-04-08 07:39:28
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艾喵喵

木虫 (正式写手)
求指导

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40楼2017-04-08 07:40:15
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