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我要睡觉

新虫 (小有名气)

连接转化没问题,pcr出了问题!如果pcr成功,就算目的片段没有连进去,也会有一条小片段。建议你提质粒后直接扩质粒,模板0.5/1.0/2.0

发自小木虫Android客户端
31楼2016-11-07 22:06:48
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上官凤舞

新虫 (正式写手)

32楼2016-11-08 08:56:19
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bnblxg

新虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by lyzjc at 2016-10-13 19:46:39
谢谢各位回复。
经自己的不断重复摸索,成功连接了一个,并且成功测序。今天做的菌液PCR鉴定也成功扩增出阳性克隆,已送去测序。

1、克隆相关的试剂一个都没有更换。
2、怀疑连接时间不够,把连接时间增加到6h ...

楼主,你好!最近我也在做TA克隆,连接效率不高,几乎没有!在AMP平板上能长出蓝白斑,可白斑基本全是假阳性,求指导哈!
PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳,试剂盒回收纯化PCR产物,电泳检测条带单一,浓度为46ng/微升。
PCR产物和pUcm载体连接,连接体系是:PCR产物5微升,pUcm-T vector 1微升,Ligation Mix 6微升。25℃连接30min,使用的是水浴锅。
LB平板:20mg/ml的X-gal,1mol/L的IPTG,100mg/ml的AMP,培养过夜
质粒粗提:挑白斑于5mlLB液体培养基中(加5微升AMP),摇菌过夜,取菌液离心后加50微升水和等体积的酚氯仿混匀,离心,跑电泳,在电泳下看质粒的条带大小
失败了多次,一直没连接成功杨,求楼主指教哈!!!
33楼2017-02-20 14:39:08
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lyzjc

银虫 (小有名气)

引用回帖:
23楼: Originally posted by 彭江容 at 2016-11-07 20:56:29
同新人一枚,楼主你看我看看我的问题在哪里吧!我做的菌长出来了,做了菌液pcr,然后电泳检测,发现有特异性条带,但是测序后做序列比对差了很多,这是什么原因呢?谢谢!
...

菌液pcr只是一种前期检验方式,并不能说明你的菌就是你的目的序列,有可能是大小一致的非特异性扩增呢,所以,还是要以测序的结果为准。像你这种情况,我怀疑是引物特异性不好,建议更换扩增引物。
zhaijc@foxmail.com
34楼2017-03-03 19:36:36
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lyzjc

银虫 (小有名气)

引用回帖:
33楼: Originally posted by bnblxg at 2017-02-20 14:39:08
楼主,你好!最近我也在做TA克隆,连接效率不高,几乎没有!在AMP平板上能长出蓝白斑,可白斑基本全是假阳性,求指导哈!
PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳,试剂盒回收纯化PCR产物,电泳检测条带单一,浓度为46ng/微 ...

1、“连接效率不高,几乎没有”这句话是什么意思? 是平板长的蓝白斑很少么。
2、你的pcr产物加的量有点高,一定要注意载体和pcr产物的浓度比例,严格按照说明书操作,防止连接效率不高。
3、连接温度建议调到16℃,连接时间可以延长。
4、摇菌过夜之后,可以直接拿来做菌液PCR。没用过你说的方法进行质粒提取,建议使用商品化的试剂盒。
zhaijc@foxmail.com
35楼2017-03-03 19:44:28
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HOTSTAR

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lyzjc at 2016-09-21 15:44:27
自己顶一下吧

又做了一次,加了对照组,对照组菌落铺满了平板,而实验组零星的菌落,摇菌中,祝我成功。

有具体的试验步骤和心得没 做了好几个 星期 啥都没有  心累啊
36楼2017-03-18 10:53:03
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lyzjc

银虫 (小有名气)

引用回帖:
36楼: Originally posted by HOTSTAR at 2017-03-18 10:53:03
有具体的试验步骤和心得没 做了好几个 星期 啥都没有  心累啊...

实验步骤各个硕博论文上都有,心得的话你就看回帖记录吧
zhaijc@foxmail.com
37楼2017-04-07 08:08:17
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上官尹悠

金虫 (职业作家)

引用回帖:
15楼: Originally posted by lyzjc at 2016-10-13 19:46:39
谢谢各位回复。
经自己的不断重复摸索,成功连接了一个,并且成功测序。今天做的菌液PCR鉴定也成功扩增出阳性克隆,已送去测序。

1、克隆相关的试剂一个都没有更换。
2、怀疑连接时间不够,把连接时间增加到6h ...

你们要连这么就啊

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努力,追求自己的追求!
38楼2017-04-07 08:36:39
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艾喵喵

木虫 (正式写手)

我最近也一直在做,但是不知道用高保真酶测序还有突变

发自小木虫Android客户端
39楼2017-04-08 07:39:28
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艾喵喵

木虫 (正式写手)

40楼2017-04-08 07:40:15
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