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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 两个小片段与载体连接
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荷岚102

新虫 (初入文坛)

[求助] 两个小片段与载体连接 已有2人参与

两个小片段分别为400bp和600bp，与载体连接，应该以多大的比例呢？有没有比较好一点的体系，我连了好久，一直连不上

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1楼 2016-05-03 19:00:33
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mars199026

铜虫 (初入文坛)
酶切酶连理论上可以，但是效率不高！比例不好掌握，建议你先用交叠pcr融合上再做连接

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8楼2016-05-04 18:20:08
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geneyhh

金虫 (正式写手)
takara 的infusion试剂盒，一步就搞定

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11楼2016-05-05 15:48:38
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普通回帖

何子919

银虫 (小有名气)
载体 DNA 和插入 DNA 的摩尔数比一般为： 0.03 pmol ： 0.03-0.3 pmol   我就是按照这个比例范围，每次都能连上。预祝成功。
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2楼2016-05-03 19:17:14
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荷岚102

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 何子919 at 2016-05-03 19:17:14
载体 DNA 和插入 DNA 的摩尔数比一般为： 0.03 pmol ： 0.03-0.3 pmol   我就是按照这个比例范围，每次都能连上。预祝成功。

两个片段同时连也行吗？

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3楼2016-05-03 19:22:03
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边木殇

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不知道你片段两端切口是什么样的，可以先两个小的连完在和大的连，同时连效率会很低吧
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4楼2016-05-03 19:53:29
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荷岚102

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 边木殇 at 2016-05-03 19:53:29
不知道你片段两端切口是什么样的，可以先两个小的连完在和大的连，同时连效率会很低吧

片段两端分别是EcoR1,EcoRV和 EcoRV，Hind3，先两个片段连接过夜，再与载体连接？是这样吗？

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5楼2016-05-03 20:14:46
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何子919

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 荷岚102 at 2016-05-03 19:22:03
两个片段同时连也行吗？
...

嫌麻烦的话那就同时连，不过四楼说的方法你也可以考虑一下。
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6楼2016-05-03 20:58:23
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
使用无缝克隆！搞定的很快！！尤其你这个有平端位点，本来T4酶连平端效率就低很多。
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7楼2016-05-03 23:30:42
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轩辕漪

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2016-05-04 23:18:46
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奥利奥有木有

新虫 (初入文坛)
我的也连不上，我想把启动子和目的基因连起来然后再连质粒，没结果呀

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10楼2016-05-05 10:17:22
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