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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 质粒双酶切切不开
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836277455

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒双酶切切不开

pBARGPE1质粒（5518bp）双酶切总是切不开分别单酶切后发现其中一个酶把质粒线性化了，而另一个酶切过后电泳条带介于对照质粒与线性化质粒条带之间，这是什么问题呢求大神指点

质粒双酶切切不开


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1楼 2016-03-30 21:13:57
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54如来哥哥

新虫 (正式写手)
★
836277455(金币+2): 谢谢参与
不懂啊

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4楼2016-03-30 21:37:24
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harry007

新虫 (小有名气)
★
836277455(金币+2): 谢谢参与
双酶切用的buffer对不对？确定好要不要加bsa跟dtt？
配的琼脂汤浓度是多少？要切下来的条带大小多大？条带小的话胶浓度低了不容易看清

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5楼2016-03-30 22:03:47
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粒粒分明

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是不是酶切位点有问题呢？检查一下

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12楼2016-03-30 23:48:50
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836277455

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by harry007 at 2016-03-30 22:03:47
双酶切用的buffer对不对？确定好要不要加bsa跟dtt？
配的琼脂汤浓度是多少？要切下来的条带大小多大？条带小的话胶浓度低了不容易看清

用的NEB的酶，Cutsmart是通用buffer

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13楼2016-03-31 16:31:49
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harry007

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by 836277455 at 2016-03-31 16:31:49
用的NEB的酶，Cutsmart是通用buffer
...

条带大小跟胶浓度呢？

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14楼2016-03-31 16:32:52
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836277455

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 粒粒分明 at 2016-03-30 23:48:50
是不是酶切位点有问题呢？检查一下

似乎不是酶切位点的问题，宿主菌是XL-1，应该也没有甲基化修饰

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15楼2016-03-31 16:34:07
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lxkui_sina

金虫 (小有名气)
分开切不就得了

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16楼2016-03-31 17:06:20
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836277455

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by harry007 at 2016-03-31 16:32:52
条带大小跟胶浓度呢？
...

浓度百分之一，要切下来的条带两千左右

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17楼2016-03-31 17:31:49
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836277455

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by lxkui_sina at 2016-03-31 17:06:20
分开切不就得了

试过了，切不开......

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18楼2016-03-31 17:32:09
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solomon7811

新虫 (小有名气)
★
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5楼: Originally posted by harry007 at 2016-03-30 22:03:47
双酶切用的buffer对不对？确定好要不要加bsa跟dtt？
配的琼脂汤浓度是多少？要切下来的条带大小多大？条带小的话胶浓度低了不容易看清

对的，双酶切两个酶的buffer要最好一样，如不一样要看下在使用buffer中的效率。

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19楼2016-03-31 17:32:11
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836277455

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by lxkui_sina at 2016-03-31 17:06:20
分开切不就得了

先一个酶切，纯化了再用另一个酶切

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20楼2016-03-31 17:32:42
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rfywoaini

银虫 (初入文坛)
★
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酶切的buffer是这个公司的么，不然就换其他公司的酶呗，比如说takara

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21楼2016-03-31 22:14:27
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54如来哥哥2楼
2016-03-30 21:37   回复  
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54如来哥哥3楼
2016-03-30 21:37   回复  
836277455(金币+2): 谢谢参与
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xtuchen6楼
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xtuchen7楼
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chentao9楼
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chentao10楼
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