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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » Bgl2和Hind3双酶切切不开
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胡晓凤

银虫 (小有名气)

[求助] Bgl2和Hind3双酶切切不开 已有4人参与

各位大侠：
   我用Bgl2和Hind3双酶切酶切我的重组质粒只能切除一条8000bp左右的条带（正确的应该是一条1700bp，一条6300bp），但是分别用这两个酶单酶切也能切出同样大小的条带，之后我用Bgl2酶切后回收再用Hind3酶切，还是切出同样大小的条带。我需要回收我双酶切之后其中的一个片段，请问我应该怎么做？
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1楼 2014-07-21 16:15:17
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-07-22 08:34:41
LZ你的载体提质粒的时候能看到超螺旋吧，而且你的这两个酶的识别位点在基因的两侧对吧，如果有超螺旋单酶切都能把载体线性化说明酶本身没问题而且载体上有识别位点，但是好像两个酶放一块就只有一个酶起作用。
1.一种可能是你的两个酶的酶切buffer是不是不兼容导致双酶切一个酶不起作用，你的内切酶是哪个公司的酶？LZ你后期做了分步酶切是如何做的？
2.另一种可能是你基因一侧的酶的酶切位点没有用，假设你基因一端的酶切位点BglII因为突变失效了，而在HandIII的酶切位点很近的地方存在另一个BglII的酶切位点，这样两个单酶切都能切出来一条带，而双酶切切出了一条近似于你质粒长度的条带和一条很小的条带，就跟做双酶切空载体把两酶切位点间的MCS切掉一样，电泳也检测不出来那个小的，而你双酶切和分步酶切的结果也给人一种只有一个酶起作用的假象。
这两个内切酶都不受甲基化影响，后一种可能性比较大，所以你这种情况必须测序验证一下，另外筛查一下你重组质粒这两个酶切位点外侧的载体序列上是否有另一个酶切位点
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胡晓凤
大家相互帮助哈
4楼2014-07-21 23:37:58
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胡晓凤

银虫 (小有名气)
自己顶一下，谁来救救我呀
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2楼2014-07-21 20:49:04
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-07-22 08:34:35
首先确认两个酶切位点都在：
1）可以测序分析（最稳妥）
2）也可以进行单切分析，但前提是你的质粒的质量比较好（未酶切的质粒以超螺旋为主，其电泳位置与单切后线性化质粒的位置明显不同），电泳时以未酶切的质粒为对照，以判断单酶切是否成功，进而判断酶切位点是否正常
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3楼2014-07-21 22:08:44
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-07-22 08:34:45
楼主给的信息太少，如果能够把质粒图谱放上来可能会更容易参考，知道具体的酶切位点数量和位置更容易判断问题在哪儿。
1. 有可能质粒重组使得你的酶切位点产生了移位，最好的办法是测序。如果质粒较大，起码把这两个酶切位点检测一下
2.单切没问题的话，检查一下你双切时候用的Buffer是否是两个酶都有100%活性的。
3.有可能其中一个位点（把8k切成1.7k和6.3k的那个位点）已经突变消失，或者是移位到另一个位点的附近，所以当再切的时候只能切出一个很小的片段，留下的片段与8k相近。同样需要用测序来确认。
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胡晓凤
下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
5楼2014-07-22 03:09:08
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胡晓凤

银虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 23:37:58
LZ你的载体提质粒的时候能看到超螺旋吧，而且你的这两个酶的识别位点在基因的两侧对吧，如果有超螺旋单酶切都能把载体线性化说明酶本身没问题而且载体上有识别位点，但是好像两个酶放一块就只有一个酶起作用。
1.一 ...

这个重组质粒之前是测过序的，应该是不存在突变的问题。buffer的话我们是参照宝生物的双酶切的buffer，酶用的也是宝生物的。后期做的分步酶切是先用bgl2和10*H buffer 2h，切胶回收 ，用Hind3和10* M buffer 2h。
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6楼2014-07-22 11:35:05
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胡晓凤

银虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-22 03:09:08
楼主给的信息太少，如果能够把质粒图谱放上来可能会更容易参考，知道具体的酶切位点数量和位置更容易判断问题在哪儿。
1. 有可能质粒重组使得你的酶切位点产生了移位，最好的办法是测序。如果质粒较大，起码把这两 ...

这是质粒图谱，我的重组质粒之前是测过序的，都没有问题，难道在接菌转接的过程中会出现突变什么的吗？
Bgl2和Hind3双酶切切不开
11.jpg


Bgl2和Hind3双酶切切不开-1
123.jpg
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7楼2014-07-22 11:45:42
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
胡晓凤(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:46:38
引用回帖:
6楼: Originally posted by 胡晓凤 at 2014-07-22 11:35:05
这个重组质粒之前是测过序的，应该是不存在突变的问题。buffer的话我们是参照宝生物的双酶切的buffer，酶用的也是宝生物的。后期做的分步酶切是先用bgl2和10*H buffer 2h，切胶回收 ，用Hind3和10* M buffer 2h。...

既然你各方面都排查了那结果就很奇怪了，至于转接导致突变的概率极低，你的宿主菌是什么JM109？DH5α？
1.你把你提取的重组质粒、重组质粒双酶切、两个单酶切和分步酶切的电泳图发上来看一下。你单酶切也是37度2个小时切的吗？
2.你的分步酶切再反着来一次，就是HandIII先来，DNA纯化，bglII再切。
第二次切3个小时。
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大家相互帮助哈
8楼2014-07-22 16:22:02
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
胡晓凤(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:46:50
引用回帖:
7楼: Originally posted by 胡晓凤 at 2014-07-22 11:45:42
这是质粒图谱，我的重组质粒之前是测过序的，都没有问题，难道在接菌转接的过程中会出现突变什么的吗？

11.jpg

123.jpg
...

1. 你的测序是在提质粒做酶切之前还是之后？就是说测序之后你是直接做酶切还是做了菌转化、提质粒再酶切的。如果是后者，有可能是在转化时发生重组，虽然可能性很小。最好把你用于酶切的质粒也做一下测序，只需要测HindIII-BglII这个区间就好。
2.如果测序没有问题，那么问题就出在酶切上。看你之前说的，两个酶的工作Buffer并不一样。单切没问题，说明酶和Buffer都没问题。你做分别单切的时候有电泳图么？最好跑一个胶，同时跑单、双切以及未切质粒，发上来参考一下。
3.在分次单切的时候，其实没有必要做切胶提质粒。个人觉得切胶提质粒的纯度和回收量并不好，有可能影响后续。你第一次单切后完全可以用PCR提纯柱。反正你切完第二次之后还是要切胶的，能少一次损耗是一次。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
9楼2014-07-22 18:32:42
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catqliu

新虫 (初入文坛)
用过双酶切设计软件试试看吗

http://muchong.com/html/201202/4137061.html
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10楼2014-07-22 23:16:12
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