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Bgl2和Hind3双酶切切不开 已有4人参与
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各位大侠： 我用Bgl2和Hind3双酶切酶切我的重组质粒只能切除一条8000bp左右的条带（正确的应该是一条1700bp，一条6300bp），但是分别用这两个酶单酶切也能切出同样大小的条带，之后我用Bgl2酶切后回收再用Hind3酶切，还是切出同样大小的条带。我需要回收我双酶切之后其中的一个片段，请问我应该怎么做？ |
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luwei13566
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【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-07-22 08:34:41
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LZ你的载体提质粒的时候能看到超螺旋吧，而且你的这两个酶的识别位点在基因的两侧对吧，如果有超螺旋单酶切都能把载体线性化说明酶本身没问题而且载体上有识别位点，但是好像两个酶放一块就只有一个酶起作用。 1.一种可能是你的两个酶的酶切buffer是不是不兼容导致双酶切一个酶不起作用，你的内切酶是哪个公司的酶？LZ你后期做了分步酶切是如何做的？ 2.另一种可能是你基因一侧的酶的酶切位点没有用，假设你基因一端的酶切位点BglII因为突变失效了，而在HandIII的酶切位点很近的地方存在另一个BglII的酶切位点，这样两个单酶切都能切出来一条带，而双酶切切出了一条近似于你质粒长度的条带和一条很小的条带，就跟做双酶切空载体把两酶切位点间的MCS切掉一样，电泳也检测不出来那个小的，而你双酶切和分步酶切的结果也给人一种只有一个酶起作用的假象。 这两个内切酶都不受甲基化影响，后一种可能性比较大，所以你这种情况必须测序验证一下，另外筛查一下你重组质粒这两个酶切位点外侧的载体序列上是否有另一个酶切位点 |
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胡晓凤
4楼2014-07-21 23:37:58
2楼2014-07-21 20:49:04
panda73
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3楼2014-07-21 22:08:44
【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-07-22 08:34:45
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楼主给的信息太少，如果能够把质粒图谱放上来可能会更容易参考，知道具体的酶切位点数量和位置更容易判断问题在哪儿。 1. 有可能质粒重组使得你的酶切位点产生了移位，最好的办法是测序。如果质粒较大，起码把这两个酶切位点检测一下 2.单切没问题的话，检查一下你双切时候用的Buffer是否是两个酶都有100%活性的。 3.有可能其中一个位点（把8k切成1.7k和6.3k的那个位点）已经突变消失，或者是移位到另一个位点的附近，所以当再切的时候只能切出一个很小的片段，留下的片段与8k相近。同样需要用测序来确认。 |
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5楼2014-07-22 03:09:08
6楼2014-07-22 11:35:05
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luwei13566
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8楼2014-07-22 16:22:02
【答案】应助回帖
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胡晓凤(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:46:50
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1. 你的测序是在提质粒做酶切之前还是之后？就是说测序之后你是直接做酶切还是做了菌转化、提质粒再酶切的。如果是后者，有可能是在转化时发生重组，虽然可能性很小。最好把你用于酶切的质粒也做一下测序，只需要测HindIII-BglII这个区间就好。 2.如果测序没有问题，那么问题就出在酶切上。看你之前说的，两个酶的工作Buffer并不一样。单切没问题，说明酶和Buffer都没问题。你做分别单切的时候有电泳图么？最好跑一个胶，同时跑单、双切以及未切质粒，发上来参考一下。 3.在分次单切的时候，其实没有必要做切胶提质粒。个人觉得切胶提质粒的纯度和回收量并不好，有可能影响后续。你第一次单切后完全可以用PCR提纯柱。反正你切完第二次之后还是要切胶的，能少一次损耗是一次。 |
9楼2014-07-22 18:32:42
10楼2014-07-22 23:16:12
