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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 出现非目的条带的原因
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xxz紫桐

铜虫 (初入文坛)

[求助] 出现非目的条带的原因 已有4人参与

请教一下，出现非目的的条带主要是可能是什么原因？
对引物进行试验，结果是不可能出现条带的，可是还是出现了，是跟扩增程序有关系吗？
左边是用95℃  30s，58℃  30s，72℃  60s ，30个cycles扩增的，右边是95℃  30s，54℃  5min，72℃  60s ，5 cycles；95℃  30s，60℃  30s，72℃  60s，30个cycles。
左边不出现条带是正常的，可为什么右边拖带那么严重，是有非特异性条带出现吗？

出现非目的条带的原因
3.jpg
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1楼 2016-03-18 09:17:58
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这个模板应该是大片段或者基因组吧，你是如何确定引物是不可能有非特异性条带呢，看你的图，感觉不仅仅 是pcr条件的问题，更可能是引物质量不行。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
2楼2016-03-18 09:36:51
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xxz紫桐

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-18 09:36:51
你这个模板应该是大片段或者基因组吧，你是如何确定引物是不可能有非特异性条带呢，看你的图，感觉不仅仅 是pcr条件的问题，更可能是引物质量不行。

因为设计引物时是专门设计了在模板里面找不到的片段的，有在NCBI上面比对过的。
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3楼2016-03-18 10:26:49
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王爱沫1

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
4楼2016-03-18 11:11:16
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xxz紫桐 at 2016-03-18 10:26:49
因为设计引物时是专门设计了在模板里面找不到的片段的，有在NCBI上面比对过的。...

我懂你的意思，我们平时设计引物都是选定特定的一段序列来设计的，即在设计是显示没有非特异性结合的。但是到我们实际来进行pcr的时候，我们用的模板往往不紧紧是引物设计时的那一段序列，还有两边延伸很长的，这样引物设计时的得分之类就不一定有参考价值了。特别是基因组设计引物时，由于软件和电脑限制，把整个基因组拿来设计引物不太现实。

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5楼2016-03-18 11:14:29
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xxz紫桐

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-18 11:14:29
我懂你的意思，我们平时设计引物都是选定特定的一段序列来设计的，即在设计是显示没有非特异性结合的。但是到我们实际来进行pcr的时候，我们用的模板往往不紧紧是引物设计时的那一段序列，还有两边延伸很长的，这样 ...

那这样子是证明这条引物不可以用吗？除了引物有没有可能有别的原因，因为换引物的话，会很麻烦。
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6楼2016-03-18 16:29:51
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我是鱼豆腐

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
绝对是引物问题，特异性不够好，你换个文献里使用过的
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7楼2016-03-18 16:33:13
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xxz紫桐

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-18 11:14:29
我懂你的意思，我们平时设计引物都是选定特定的一段序列来设计的，即在设计是显示没有非特异性结合的。但是到我们实际来进行pcr的时候，我们用的模板往往不紧紧是引物设计时的那一段序列，还有两边延伸很长的，这样 ...

这几条引物，我是在NCBI上直接用序列比对的，确定说找不到基因组的序列才使用的，这样子也没办法保证引物的可行性吗？原本就是要设计不在该基因组的序列的，那这样子，要怎么确保重新设计的引物不会有什么问题呢？
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8楼2016-03-18 16:33:48
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xxz紫桐

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 我是鱼豆腐 at 2016-03-18 16:33:13
绝对是引物问题，特异性不够好，你换个文献里使用过的

这个还真没办法，引物的使用方法不一样，所需要的引物序列等等也就不一样了，文献上使用过的，不是没考虑过，可是找不到符合条件的。除了换引物，就没有别的办法了吗？
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9楼2016-03-18 16:36:01
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by xxz紫桐 at 2016-03-18 16:29:51
那这样子是证明这条引物不可以用吗？除了引物有没有可能有别的原因，因为换引物的话，会很麻烦。...

额，你的模板是什么

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10楼2016-03-18 18:35:21
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