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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 巢式PCR第二轮PCR总是出现非特异性条带，且目的条带不见？
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yxtkttkl

新虫 (初入文坛)

[求助] 巢式PCR第二轮PCR总是出现非特异性条带，且目的条带不见？ 已有3人参与

请教各位前辈，最近做巢式PCR，第一轮PCR效果非常好，第二轮PCR的时候用了5μl（3μl的也用过）第一轮PCR产物，在阳对、阴对（水）和样品中均出现了一条带，此带比目的条带小约十几bp（估计的），而目的条带没有发现（或有很暗很暗的一条），请教大家帮忙分析原因？
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1楼 2015-11-10 13:51:27
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动力泉

金虫 (正式写手)
有污染，建议buffer水等共用试剂全部换掉，二轮PCR时最好讲一轮产物稀释

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好好学习
2楼2015-11-10 13:59:58
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yxtkttkl

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 动力泉 at 2015-11-10 13:59:58
有污染，建议buffer水等共用试剂全部换掉，二轮PCR时最好讲一轮产物稀释

污染已经排除过了，我的引物是10uM的，加了0.5ul，25ul体系，不知道引物浓度是否偏高，另外，第二轮需要稀释多少倍合适呢？

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3楼2015-11-10 14:41:57
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动力泉

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不知该条带有没有测序确认，如没有可以测序看看；阴性对照有带污染无疑，建议将全部试剂换掉；根据一轮目的条带亮度确定稀释倍数，一般50-100倍

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好好学习
4楼2015-11-10 15:29:03
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是否可以摸一下退火温度。按说巢式PCR第一轮的产物做模板的时候加的很少的，最多1uL，有时需要稀释10倍或者50倍加1uL，你的加那么多，正常情况P出来应该是弥散带了，而你的好像却不是很亮。
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5楼2015-11-11 08:43:07
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hcf321283

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.阳性对照和阴性对照都出现条带，你就需要排查引物是否污染，mix或者单个组分是否存在污染。2.根据第一轮PCR条带的大小确定第二轮模板的量，一般0.1ng就够了，有可能还多！
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6楼2015-11-11 15:44:20
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