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prthefu

木虫 (著名写手)

[求助] 跑胶条带中,marker清晰但目的条带不够亮已有4人参与

把PCR产物进行电泳后,对1%Agarose和1.5%Agarose两个浓度下的条带图谱有小疑惑。
希望能有人帮忙解答:
    下面电泳图谱中,左、右边分别为1%和1.5%Agarose的电泳图,其中1%的目的条带很亮,右边的Marker条带较为模糊;但是在1.5%Agarose的电泳图中,Marker条带清晰,目的条带却不如之前的亮,所以我现在不太确定,到底是选择哪个浓度做。
    再说明一下,我后面对PCR产物进行连接转化,所以,我是选择目的条带亮的还是Marker条带清晰的呢?

跑胶条带中,marker清晰但目的条带不够亮
1%和1.5%Agarose电泳图.jpg.JPG
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mr.clutch

新虫 (小有名气)

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-02-28 10:09:14
胶浓度并不能给你后续实验造成实质性影响啊!1%或1.5%都可以进行胶回收,关键是你的目的产物要达到足够的量才能保证你胶回收或者PCR纯化之后得到足够浓度的目的产物以满足后续连接之需

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2楼2016-02-26 00:39:22
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xiangyingliu

银虫 (小有名气)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-28 10:09:31
做连接必须要保证足够的浓度,建议你选择条带亮的那个,看你的左边几个条带都很特异而且很亮就拿他回收

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5楼2016-02-26 09:52:33
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LQF134

新虫 (初入文坛)

就选目的条带亮的回收,回收效果好,另外PCR跑胶的话点5微升的样可能会好一些

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11楼2016-02-28 10:05:20
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原海亮

木虫 (著名写手)

首先高浓度的胶对于片段的分离效果较好,特别是小片段的分离,所以相对来讲你的高浓度的marker条带分离较好,同时高浓度胶对于染色效果也是有点影响的,所以整体条带亮度不高也正常;其次,目的条带的亮度问题,如果你是同一样品点了不同胶,那么不用考虑那么多,本身你胶的制备,胶的厚度,染色效果,上样量都会有误差,这个亮度差异没有什么指导意义,并且对你回收目的条带没有影响。最后,无论是做载体酶切回收还是pcr回收,都尽量获得高浓度的产物来进行,毕竟胶回收的过程会有一部分目的片段损失,祝好!

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12楼2016-02-28 10:32:38
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
20楼: Originally posted by prthefu at 2016-03-01 08:19:34
做连接时需要高浓度的产物,但是,怎样获得高浓度呢?我昨晚胶回收后,再次跑胶检测时,发现纯度可以,但是不是特别亮,这就代表浓度不是很高吗?亮度和浓度是对应的吗?...

亮度和浓度是有一定的参考价值的(相同上样量),获得高浓度的目的条带进行连接,不一定就可以获得较高正确率的转化子,连接的关键在于片段的酶切处理是否完全,如果酶切没有问题,片段浓度较低的话,可以适当调整连接体系,比如20微升,目的是可以多加入一些低浓度的片段,这样基本上可以满足普通克隆转化的(建库转化建议尽量获得高质量片段),,

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21楼2016-03-01 11:53:15
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管昌红

新虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by mr.clutch at 2016-02-26 00:39:22
胶浓度并不能给你后续实验造成实质性影响啊!1%或1.5%都可以进行胶回收,关键是你的目的产物要达到足够的量才能保证你胶回收或者PCR纯化之后得到足够浓度的目的产物以满足后续连接之需
...

我回收前很亮 回收后为啥不亮了呢!洗脱了两次

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3楼2016-02-26 01:36:26
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prthefu

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by mr.clutch at 2016-02-26 00:39:22
胶浓度并不能给你后续实验造成实质性影响啊!1%或1.5%都可以进行胶回收,关键是你的目的产物要达到足够的量才能保证你胶回收或者PCR纯化之后得到足够浓度的目的产物以满足后续连接之需
...

再重复做1%Agarose跑胶,发现同样的条件,目的条带跑出的比如之前的亮,如果做胶回收,是不是要求目的条带要足够亮,而且,我还想问,做胶用的是那种大孔胶,上样量应该是多少啊,还有,在切胶时,都需要注意上么啊
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4楼2016-02-26 09:19:46
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fudan671

木虫 (著名写手)

marker明显没有跑开,建议增加时间,量加5微升
6楼2016-02-26 09:54:53
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

关键是你的目的条带大小是多少啊?
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
7楼2016-02-26 13:53:17
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prthefu

木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 18761615793 at 2016-02-26 13:53:17
关键是你的目的条带大小是多少啊?

图中亮色条带就是我的目的条带,到我现在想搞清楚,为什么两个农夫下,一个是目的条带更亮,一个是marker跑的更好

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2016-02-26 16:13:43
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lucialee0807

铜虫 (初入文坛)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-28 10:09:48
你可以做个对比实验,同样的产物同样的量点不同的胶,marker也点一样的,跑胶的程度也是一样的,要跑到一样的位置,不要像这样左边的跑的开一点,然后再对比下看看

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9楼2016-02-26 17:01:14
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hawkinghj

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-28 10:10:03
引用回帖:
8楼: Originally posted by prthefu at 2016-02-26 16:13:43
图中亮色条带就是我的目的条带,到我现在想搞清楚,为什么两个农夫下,一个是目的条带更亮,一个是marker跑的更好
...

两块胶大小不一样,点样孔大小自然不一样,点的样品和marker量也会有差别,楼主不要纠结这些细节啦,能回收到最多的目的条带就行。
10楼2016-02-28 09:32:32
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