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prthefu

木虫 (著名写手)

[求助] 跑胶条带中,marker清晰但目的条带不够亮已有4人参与

把PCR产物进行电泳后,对1%Agarose和1.5%Agarose两个浓度下的条带图谱有小疑惑。
希望能有人帮忙解答:
    下面电泳图谱中,左、右边分别为1%和1.5%Agarose的电泳图,其中1%的目的条带很亮,右边的Marker条带较为模糊;但是在1.5%Agarose的电泳图中,Marker条带清晰,目的条带却不如之前的亮,所以我现在不太确定,到底是选择哪个浓度做。
    再说明一下,我后面对PCR产物进行连接转化,所以,我是选择目的条带亮的还是Marker条带清晰的呢?

跑胶条带中,marker清晰但目的条带不够亮
1%和1.5%Agarose电泳图.jpg.JPG
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原海亮

木虫 (著名写手)

首先高浓度的胶对于片段的分离效果较好,特别是小片段的分离,所以相对来讲你的高浓度的marker条带分离较好,同时高浓度胶对于染色效果也是有点影响的,所以整体条带亮度不高也正常;其次,目的条带的亮度问题,如果你是同一样品点了不同胶,那么不用考虑那么多,本身你胶的制备,胶的厚度,染色效果,上样量都会有误差,这个亮度差异没有什么指导意义,并且对你回收目的条带没有影响。最后,无论是做载体酶切回收还是pcr回收,都尽量获得高浓度的产物来进行,毕竟胶回收的过程会有一部分目的片段损失,祝好!

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天空才是极限,我有信心飞的更高!
12楼2016-02-28 10:32:38
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
20楼: Originally posted by prthefu at 2016-03-01 08:19:34
做连接时需要高浓度的产物,但是,怎样获得高浓度呢?我昨晚胶回收后,再次跑胶检测时,发现纯度可以,但是不是特别亮,这就代表浓度不是很高吗?亮度和浓度是对应的吗?...

亮度和浓度是有一定的参考价值的(相同上样量),获得高浓度的目的条带进行连接,不一定就可以获得较高正确率的转化子,连接的关键在于片段的酶切处理是否完全,如果酶切没有问题,片段浓度较低的话,可以适当调整连接体系,比如20微升,目的是可以多加入一些低浓度的片段,这样基本上可以满足普通克隆转化的(建库转化建议尽量获得高质量片段),,

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天空才是极限,我有信心飞的更高!
21楼2016-03-01 11:53:15
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