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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Western Blot实验的蛋白条带都连在一起
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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zplipeng

金虫 (著名写手)

[交流] Western Blot实验的蛋白条带都连在一起

如题：
探测内参actin的时候，各个条带并不很浓，但都连在一起，看不出泳道来。
会是什么原因。
另：有时转膜会出现星星样的小点，布满整个凝胶。
    大分子量蛋白往往有转移不好的情况，虽然并不影响自己探测的蛋白。
以下附上WB的详细步骤：
1、        细胞总蛋白的提取
A、        用培养皿（10cm）或培养瓶（75cm2）将细胞（Hela或HepG2）培养至约80-90%的平铺率；
B、        倒去培养基，并用PBS冲洗2-3次；
C、        加入0.5-1ml胰酶，37℃消化3-10min；
D、        加入3mL无血清培养基终止消化反应，并用枪头反复吹打至细胞从培养壁上脱落；
E、        收集细胞悬液至15mL离心管中，1500rpm离心10min收集细胞体（约100uL体积大小）；
F、        用500uL PBS重悬细胞并转移至1.5mL离心管中，3000-5000rpm离心5min收集细胞；
G、        弃去上清并用枪头吸干液体，加入50-200uL裂解液（RIPA已加入蛋白酶抑制剂），吹打均匀后，冰上放置20min，液氮反复冻融2-3次；
H、        14000×g离心15min，将上清收集到新的离心管中；
I、        以BSA为基准测定蛋白吸光度及浓度（约5-35mg/mL）。
2、        SDS-PAGE
A、        配置12%的分离胶（20mL）和3%的浓缩胶（10mL）；
B、        用2×Loading buffer（15uL）与蛋白提取液（15uL）等体积混匀后，沸水浴中煮5-10min；
C、        每孔上样20uL样品，5uL预染蛋白Marker，没有样品的孔加入5uL 2×Loading buffer；
D、        调节电压100V（或先80V再120V）电泳90-120min；
E、        转膜的胶水中暂存，另一块可以直接染色（考马斯亮蓝染液中煮沸5-10min，脱色）。
3、        转膜
A、        用转膜缓冲液浸湿转膜器件（夹子、滤纸、垫片）并依次排好；
B、        将剪好的PVDF膜（0.45um）（比胶略大但比滤纸小）先在甲醇中浸湿（不超过15s），后覆盖在正极滤纸上；
C、        随后将胶覆盖在PVDF膜上；
D、        再放上一层滤纸后，用玻璃棒或15mL离心管赶出气泡；
E、        夹好夹子，放入转移槽，加满转移缓冲液；
F、        20V转移过夜，一块膜时电流大约为13-15mA，用的是六一的转移槽；
G、        转好的膜放入TBST缓冲液中。
4、        免疫印迹
A、        用TBST配置的5%脱脂奶封闭膜（4℃过夜或37℃ 1hr）；
B、        用TBST配置的5%脱脂奶作为稀释液，加入一抗（1:300（β-actin）），37℃孵育1hr（或4℃过夜）；
C、        TBST洗涤膜5min，2次，然后用TBST配置的5%脱脂奶作为稀释液，加入二抗（1:5000，牛抗兔二抗），37℃孵育1hr；
D、        TBST洗涤膜5min，2次，用于显色反应。
5、        发光反应
A、        加入一定量ECL（整块膜大约需要2.5-3mL的ECL混合液），将膜全部覆盖；
B、        5min后，移入暗室准备压片（光片剪角），视荧光强度选择压片时间；
C、        压片10s-2min，后分别显影（可在灯下观察显影强度，控制显影时间），定影（2min即可）；
D、        膜保存在TBST中，可反复利用。

总蛋白SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色：可见泳道间扩散相连



actin的WB结果 连成一条线而看不出泳道



转膜后的凝胶用考马斯亮蓝染色 有时会出现星星样的点点



但大部分还是这种情况：90kD一下蛋白转移较好，而大分子量蛋白往往转移不好（20V overnight）



[ Last edited by zplipeng on 2011-12-8 at 14:34 ]
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1楼 2011-12-04 21:15:25
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cuier124

金虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-12-06 12:18:37
zplipeng(金币+1): 用的RIPA提取缓冲液，网上找的配方。您的意思是Loading buffer中溴酚蓝质量有问题还是量加的可能不对？ 2011-12-08 14:38:38
zplipeng(金币+2): 我们的抗体是博奥森公司的（国产），1:1000的做过，出不来条带。ECL的量也有影响吗？个人觉得只要铺满整个膜是不是就可以了！转膜在300mA中转1.5h我也用过，效果也是如此。另外询问一个问题，您做过信号转导方面的东西，是不是磷酸化蛋白检测时需要的浓度时比较大的？我用非磷酸化抗体探测时可以探测到条带（也不粗），但是磷酸化蛋白的抗体总是探测不到条带，不知是真的没有表达，还是探测的问题。 2011-12-08 20:49:10
zplipeng(金币+5): 我们老板购买的Roche的蛋白酶抑制剂，他说他们做蛋白磷酸化就用这个，不用再加磷酸酶抑制剂。我表示怀疑。 2011-12-12 19:30:24
照你说的情况看，是你的蛋白样品在胶里扩散性太强了，所以可能是你样品制作的有问题吧，检查一下loading buffer的配制可有问题，特别使样品下沉的溴酚蓝；还有就是电泳时的电压和时间也会影响电泳结果；如果实验室的此实验条件不成熟，还要好好摸索啊，祝你好运！


我个人认为是Loading buffer中溴酚蓝的量的问题，质量有问题肯定也有影响；
从你的方法和图片看，个人认为：你actin抗体的浓度可能大了(我们实验室内参一抗浓度1:1000，当然具体要看抗体来源和说明)，ECL的量和压片时间没把握好，导致你actin的WB显影结果连成一条线而看不出泳道；
转膜大分子转不过来应该是你转膜条件不佳（我们实验室是300mA冰中转1.5h）
你再查些资料看看问题到底在哪儿吧，祝好运！


我觉得磷酸化的蛋白是不太好检测，蛋白少信号弱可适当加大上样量，做磷酸化的蛋白RIPA一定要加磷酸酶抑制剂，我们的RIPA是购买的含磷酸酶抑制剂的，您自己配制也应该加进去

[ Last edited by cuier124 on 2011-12-12 at 09:13 ]
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6楼2011-12-05 21:58:28
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shabz

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
31楼: Originally posted by chenxiangfan at 2013-06-09 15:07:27
为何？新手求教。...

因为脱脂奶粉含有大量酪蛋白，用这个封闭到时曝光的话会出现很高的背景 不易观察
你得用BSA做封闭液
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33楼2013-06-10 11:03:04
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zplipeng

金虫 (著名写手)
没人研究过啊？
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3楼2011-12-05 08:28:42
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yang0071

木虫 (职业作家)
膜没有封闭好
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4楼2011-12-05 08:49:59
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vine010

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zplipeng(金币+1): 蛋白量感觉也不多，因为最后的WB条带并不粗。我用的12%的分离胶。 2011-12-08 14:36:40
量加多了，胶的浓度是不是有问题。
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5楼2011-12-05 16:30:26
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cixinkejian

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zplipeng(金币+1): 界面不好？？？这个可有办法解决？ 2011-12-08 14:54:14
或许是因为配胶的时候，分离胶和浓缩胶的界面结合的不好造成的呢。
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7楼2011-12-06 00:05:37
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晴天1882

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zplipeng(金币+1): 请看图。谢谢！ 2011-12-08 14:39:03
上个图，感觉问题有可能在电泳。
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8楼2011-12-06 09:45:51
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zplipeng(金币+1): Tris的pH不对？还是说质量有问题？请详述。 2011-12-08 14:40:06
上样太多导致连在一起，信号不好是因为抗体和你的技术不好。最后可能是配胶的tris有问题。
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9楼2011-12-06 09:54:44
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lxyyzz

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zplipeng(金币+1): 我做信号通路的磷酸化探测，上样量不多探测不到。您看图中的样子，上样量是不是多了？ 2011-12-08 14:40:56
我以前做蛋白量上得过多会出现这个问题。。。不知道你是不是这个原因
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10楼2011-12-06 16:20:46
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zplipeng(金币+1): 多谢！我回头过滤一下试试，您那边浓缩胶和分离胶缓冲液的pH值是不是分别为8.8和6.8？ 2011-12-08 20:52:39
首先，配胶的所有溶液都要0.45微米滤膜过滤的，不能有杂质沉淀，都要用去离子水去配制。过硫酸铵和TEMED可能不用过滤。tris的PH值也很关键，影响条带的宽窄。
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11楼2011-12-08 15:10:32
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晴天1882

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
胶的配置是不是有问题，电泳的时候都扩散了，后面显影肯定连在一起了。
药品有没过期？操作没什么问题。
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12楼2011-12-08 15:48:00
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zplipeng(金币+2): 过滤了之后再跑胶，扩散未见明显改善。我觉得可能是由于蛋白浓度大的原因，您那边用的蛋白提取液是啥子配方啊？ 2011-12-12 10:39:57
是8.8和6.8，但是配制的时候8.8那个要半个小时才稳定，所以要稳定20min再调，调一下再等20min。过滤去杂质是为了保证条带好看。
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13楼2011-12-09 21:56:51
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
条带连在一起就是上样上多了，少上点，我们就用ripa裂细胞。
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14楼2011-12-21 10:17:14
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vivien520584

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我部太清楚你的结果怎么造成的，但是我做的时候结果还是比较好的。跟你说说我和你部一样的地方嘛。
1.胶的浓度和你部一样。2.转膜之前我的膜（醋酸）和胶都用缓冲液泡过，再减。3.清洗的时候是洗三次，每次10min。还有电泳时候的电压也不一样。
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15楼2011-12-21 11:28:39
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
上样量有点多，问题应该出在跑电泳的时候，胶出问题了，看下是不是少加了什么或者算得时候用量算错了。6楼说的也有可能，配上层胶前，封闭下层胶的水要用吸水纸吸干净，不过胶比水重，这种可能性比较小
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17楼2012-01-04 15:28:01
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1. 蛋白上样体积太大，加样时溢出，可以减少上样量或者用更厚的胶
2.浓缩胶和分离胶之间有缝隙。
3.至于染色后有很多杂点，个人认为是染色用的R250没有充分溶解或者使用次数过多形成了颗粒，应该不是蛋白胶的问题。
4.转膜条件还需摸索，我用invitrogen湿转盒，恒流300mA 1小时或者200mM 2小时大分子Marker基本上都能转过去。
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18楼2012-04-08 07:40:33
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flownaway

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
电泳时间太长，蛋白扩散了；另外抗体浓度高的话，显影的时候条带也会发生重叠
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19楼2012-05-19 23:12:02
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Roy_01

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得是胶的缓冲液的PH有问题  也有可能是上样量太大所致
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20楼2012-05-22 22:10:17
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废哥117

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
看天: 金币+3, 鼓励交流 2012-10-12 14:30:28
我有一次做β-actin也出现过这种问题，后来发现是我配的胶不好，没有混均匀，导致蛋白样品弥散，还有就是如果蛋白样品浓度过高，也会出现相邻泳道条带相连不分开的状况。个人觉得电泳要稳压慢跑，尽量跑开，转膜，稳流，我试过350毫安转2H（冰，湿转），后考染胶，发现仍有条带残留在胶上，建议350毫安转2.5H，或者400毫安转2H
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21楼2012-06-05 09:46:55
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296595127

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
看天: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-12 14:30:39
试试拔完梳子不要加样，先预电泳5-10分钟，然后冲泳道，加样
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22楼2012-08-01 21:25:19
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15929819216

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
顶，我也出现类似问题，求解。。。
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23楼2012-10-12 13:35:28
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zx1984

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉着你可能的原因：
1、电泳缓冲液用的次数太多，或是PH有问题，不过前者可能性大
2、胶配的也不好
3、上样量太大，你可以这样，先上一部分电泳，等样品刚进入浓缩胶，再将剩下的样品加上，这样可以消除上样量大而引起弥散的影响
4、溴酚蓝、考马斯亮蓝都要过滤
5、可能你测的浓度用问题
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24楼2012-12-10 13:09:03
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lvanmorison

禁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
25楼2012-12-13 00:14:09
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
上样太多了，少上点。
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26楼2012-12-13 09:33:09
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xuhaibin2049

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
第一张胶图除了要考虑Loading Buffer,也应该考虑样品的前处理，还有灌胶后是否清洗过凝胶。能够被考染上的干扰物也包括未结合的单体。再就是电泳过程中电流的监测，可以考虑用固定功率的方式。
第二张胶图最主要的原因就是压片时间过长，考虑优化ECL的浓度和压片时间，最好使用成像仪去做。
第三张，没有经历过。
第四张，除了考虑优化转移条件，提高甲醇的浓度；再就是转移时尝试将胶的方向（上样方向）一个向上，一个向下，检查湿转槽的电场效果。
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28楼2013-03-24 11:00:12
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bosir

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一般来说 有可能上样量多了 也有可能胶浓度比较低  可以试试降低上样量和改用更高浓度的胶
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29楼2013-03-30 16:03:27
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shabz

木虫 (小有名气)
★ ★
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yqbter: 金币+1, 鼓励发帖！ 2013-06-09 15:42:01
如果检测磷酸化抗体 不可以用脱脂奶粉进行封闭
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30楼2013-06-08 23:03:38
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chenxiangfan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
30楼: Originally posted by shabz at 2013-06-08 23:03:38
如果检测磷酸化抗体 不可以用脱脂奶粉进行封闭

为何？新手求教。
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31楼2013-06-09 15:07:27
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遥控器68

金虫 (小有名气)
胶没跑好
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32楼2013-06-09 17:31:15
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yuy07

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我上过80ug的蛋白都木有问题，我觉得应该是配胶的问题。希望LZ找到原因后跟大家分享一下
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34楼2013-08-20 11:03:25
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独行的小凉

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我实验中遇到过考染出现星状斑点的那种情况，配制染色液之后至少要把染色液用滤纸过一下再用于染色，就能避免，是考马斯亮蓝中可能存在不溶的颗粒造成的吧~
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35楼2013-09-24 20:39:18
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独行的小凉

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
34楼: Originally posted by yuy07 at 2013-08-20 11:03:25
我上过80ug的蛋白都木有问题，我觉得应该是配胶的问题。希望LZ找到原因后跟大家分享一下

这个，请教一下，上样最多也就是30-40微升的样子，浓度要到2微克每微升，不会有影响么？没有上过那么高浓度的，一般都是尽量稀释到1个多微克每微升~
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36楼2013-09-24 20:42:11
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独行的小凉

金虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 296595127 at 2012-08-01 21:25:19
试试拔完梳子不要加样，先预电泳5-10分钟，然后冲泳道，加样

求解释原理~
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37楼2013-09-24 20:43:52
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bosir

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议改用4-5%浓缩胶，电泳采用70V 40min+100V跑完，还有，你配胶的所有溶液换掉。配完胶用湿纸巾包起来，保鲜膜封好放在4°C过夜，使胶完全聚合。
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38楼2013-09-24 21:32:45
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简单回复
harbor20102楼
2011-12-04 21:26   回复  
quanwa0116楼
2012-01-03 21:12   回复  
su-b0827楼
2012-12-13 10:08   回复  
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[考研] 各位老师好，我的一志愿为北京科技大学085601材料专硕 +13 Koxui 2026-03-28 13/650 2026-04-02 09:35 by 哒哒哒呱呱呱
[考研] 一志愿 南京航空航天大学 ，080500材料科学与工程学硕 +7 @taotao 2026-03-30 7/350 2026-04-01 14:30 by chenqifeng666
[考研] 301求调剂 +8 axibli 2026-04-01 8/400 2026-04-01 09:51 by 我的船我的海
[考研] 085600，专业课化工原理，320分求调剂 +6 大馋小子 2026-03-29 6/300 2026-03-31 10:03 by 氯化亚硝酰
[考研] 一志愿大连理工大学材料求调剂 +6 Gymno 2026-03-30 6/300 2026-03-31 07:26 by 无际的草原
[考研] 0703 化学 求调剂，一志愿山东大学 342 分 +7 Shern—- 2026-03-28 7/350 2026-03-30 16:31 by nothing投稿中
[考研] 312，生物学求调剂 +3 小译同学abc 2026-03-28 3/150 2026-03-28 15:32 by 落睿可思
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