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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助，只有CDS序列，如何设计引物扩增全长基因？
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一张七块的

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助，只有CDS序列，如何设计引物扩增全长基因？ 已有4人参与

用来构建载体的，导师只给了CDS的序列，放在DNAman里设计出的引物扩增出的都不是全长可咋整？
不是全长没法用吧。。。
直接用这个基因两端的序列设计引物行吗？
必须要知道基因两端外的序列吗？
怎么才能弄到两端的序列？
新人求罩。。。
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1楼 2016-02-20 16:38:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jackyoung

新虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 一张七块的 at 2016-02-21 12:58:55
哦，那就从两端的UTR区设计引物哈~还要连酶切位点和保护碱基什么的，不知多长的引物比较合适呢?
...

我年轻的时候也总是觉得可以一步到位，不懂的到处问，嫌麻烦的就按最理想的情况搞，然而现实跟理想和瞎想不一样，这本身也是个实验科学。年轻人不要怕失败，用心自己去做一回就明白了。你可以设计几套不同的方案同时搞，看看效果做做比较，也算是交个学费吧。
简单的东西或者是运气好怎么搞都能成，真正有难度的全招呼上了可能还要反复几遍。这种事儿就是你步入科研大门的辛酸，有的人不屑的一个基因克隆，你却实实在在搞了一月有余…

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CestLaVie
11楼2016-02-21 13:15:13
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生化与分子

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-02-21 22:30:19
可以在NCBI中序列比对找出基因，然后根据基因号找基因全长，或者前面从ATG开始取21个左右的碱基加上酶切位点，后面TAA向前取21个左右的碱基反向互补作为下游引物加上酶切位点，以gDNA为模板去扩增，就可以扩增出基因全长。
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2楼2016-02-20 20:12:45
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jackyoung

新虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-02-21 22:30:38
CDS是编码序列，如果确定给的是全长编码序列，括增出来构建载体（如果是为了表达蛋白的话）是没有问题的。
如果不是说一定要带编码区以外的序列（比如研究内含子保留或UTR的调控功能），没有必要得到全长mRNA/cDNA序列。
如果一定要得到，建议先查询数据库找信息，实在不行再RACE。其实直接从文库中筛选也是个不错的方法。

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CestLaVie
5楼2016-02-21 00:06:05
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轩辕漪

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
13楼2016-02-21 13:52:45
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普通回帖

williamwjj

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
1楼: Originally posted by 一张七块的 at 2016-02-20 16:38:15
用来构建载体的，导师只给了CDS的序列，放在DNAman里设计出的引物扩增出的都不是全长可咋整？
不是全长没法用吧。。。
直接用这个基因两端的序列设计引物行吗？
必须要知道基因两端外的序列吗？
怎么才能弄到两 ...

你的意思是要获得mrna全长吗？要做Race PCR，分别得到5'utr和3'utr

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3楼2016-02-20 21:22:26
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一张七块的

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 生化与分子 at 2016-02-20 20:12:45
可以在NCBI中序列比对找出基因，然后根据基因号找基因全长，或者前面从ATG开始取21个左右的碱基加上酶切位点，后面TAA向前取21个左右的碱基反向互补作为下游引物加上酶切位点，以gDNA为模板去扩增，就可以扩增出基因 ...

这样取出来的引物好用吗？不会出现比如引物二聚体，退火温度不一致等等的问题吗？
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4楼2016-02-20 21:41:53
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一张七块的

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jackyoung at 2016-02-21 00:06:05
CDS是编码序列，如果确定给的是全长编码序列，括增出来构建载体（如果是为了表达蛋白的话）是没有问题的。
如果不是说一定要带编码区以外的序列（比如研究内含子保留或UTR的调控功能），没有必要得到全长mRNA/cDNA序 ...

直接用CDS两端的序列设计引物吗?我用软件试了一下，会有引物二聚体和发卡结构怎么办?

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6楼2016-02-21 12:40:30
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jackyoung

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一张七块的: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2016-02-23 07:59:57
引用回帖:
6楼: Originally posted by 一张七块的 at 2016-02-21 12:40:30
直接用CDS两端的序列设计引物吗?我用软件试了一下，会有引物二聚体和发卡结构怎么办?
...

这种方法挺呵呵的，以前也这么搞，那个杂带啊…
你就不能查查信息从UTR区域设计引物从cDNA里搞出来么？搞到T-载体上随便招呼。虽然看着麻烦，但是我们组都这么干，感觉最靠谱。

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CestLaVie
7楼2016-02-21 12:44:50
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jackyoung

新虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by 一张七块的 at 2016-02-21 12:40:30
直接用CDS两端的序列设计引物吗?我用软件试了一下，会有引物二聚体和发卡结构怎么办?
...

还有 引物设计软件是软件，实际括增去用才是王道。你想想看那么大的基因组，转录出来乱七八糟也不少，错配什么的都再正常不过了。我们的经验是用最特异的引物搞出来，弄到T-载体上随便玩。

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CestLaVie
8楼2016-02-21 12:48:54
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一张七块的

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jackyoung at 2016-02-21 12:48:54
还有 引物设计软件是软件，实际括增去用才是王道。你想想看那么大的基因组，转录出来乱七八糟也不少，错配什么的都再正常不过了。我们的经验是用最特异的引物搞出来，弄到T-载体上随便玩。
...

哦，那就从两端的UTR区设计引物哈~还要连酶切位点和保护碱基什么的，不知多长的引物比较合适呢?

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9楼2016-02-21 12:58:55
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一张七块的

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jackyoung at 2016-02-21 12:48:54
还有 引物设计软件是软件，实际括增去用才是王道。你想想看那么大的基因组，转录出来乱七八糟也不少，错配什么的都再正常不过了。我们的经验是用最特异的引物搞出来，弄到T-载体上随便玩。
...

另外，这个CDS是两段，中间是有一段内含子的，做转基因，需要把内含子去掉吗?如果需要的话，怎么去掉?

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10楼2016-02-21 13:09:56
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