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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助，只有CDS序列，如何设计引物扩增全长基因？
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jackyoung

新虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 一张七块的 at 2016-02-21 12:58:55
哦，那就从两端的UTR区设计引物哈~还要连酶切位点和保护碱基什么的，不知多长的引物比较合适呢?
...

我年轻的时候也总是觉得可以一步到位，不懂的到处问，嫌麻烦的就按最理想的情况搞，然而现实跟理想和瞎想不一样，这本身也是个实验科学。年轻人不要怕失败，用心自己去做一回就明白了。你可以设计几套不同的方案同时搞，看看效果做做比较，也算是交个学费吧。
简单的东西或者是运气好怎么搞都能成，真正有难度的全招呼上了可能还要反复几遍。这种事儿就是你步入科研大门的辛酸，有的人不屑的一个基因克隆，你却实实在在搞了一月有余…

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CestLaVie
11楼2016-02-21 13:15:13
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jackyoung

新虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 一张七块的 at 2016-02-21 13:09:56
另外，这个CDS是两段，中间是有一段内含子的，做转基因，需要把内含子去掉吗?如果需要的话，怎么去掉?
...

没有听说过怎么去内含子，从cDNA里括增不就好了么。

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CestLaVie
12楼2016-02-21 13:18:10
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轩辕漪

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
13楼2016-02-21 13:52:45
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hanyu426980

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果要全长直接用CDS 5‘端和3’端取个25bp然后在软件里适当调整，引物二聚体什么的并无大碍，只要保证错配少一点，两引物退火温度不要相差太多就行了，一直构建载体都这么设计，没问题。
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14楼2016-02-21 16:02:08
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sunlk

铜虫 (正式写手)
看看CDS开头和结尾的GC含量，如果很高，超过60%，就会有很强的发夹结构，二聚体，如果少于60%，从ATG开始就行，一般都能扩出来。需要基因mRNA的全长，一般是CDS开头结尾GC含量太高扩不出来，或者CDS太短，后续胶回收效率太低，可以在5“UTR及3;UTR区域选择相应的引物。
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很给力
15楼2016-02-23 08:33:01
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15836073150

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by jackyoung at 2016-02-21 13:15:13
我年轻的时候也总是觉得可以一步到位，不懂的到处问，嫌麻烦的就按最理想的情况搞，然而现实跟理想和瞎想不一样，这本身也是个实验科学。年轻人不要怕失败，用心自己去做一回就明白了。你可以设计几套不同的方案同 ...

你好前辈，我现在遇到个问题，我需要小麦的DREB抗旱基因，可是在NCBI上一搜，可以搜到好多的mRNA，我该怎么选择用哪一个那，还有老师让我找的是DREB的基因全长，包括启动子部分，真不知道从哪入手。望前辈指点指点。
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16楼2016-02-24 10:09:25
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ff-Wan

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by jackyoung at 2016-02-21 13:15:13
我年轻的时候也总是觉得可以一步到位，不懂的到处问，嫌麻烦的就按最理想的情况搞，然而现实跟理想和瞎想不一样，这本身也是个实验科学。年轻人不要怕失败，用心自己去做一回就明白了。你可以设计几套不同的方案同 ...

我也初学基因克隆，引物都反反复复设计了好几次了，还是扩增不出来。转录组里获得目的基因的部分序列，比对后发现序列里有完整的CDS区，但是不知道要怎么设计引物才能将整个编码区全扩出来，之前在起始密码子和终止密码子外围（CDs区两端）设计的，一个都没扩出来，在CDs区里面设计能扩全长吗？
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17楼2019-07-15 20:38:21
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