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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 关于大肠杆菌诱导表达
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梦的金色城堡

新虫 (小有名气)

[求助] 关于大肠杆菌诱导表达 已有2人参与

用的是pet29b，我的蛋白37度3h诱导后全部是包涵体，很明显，上清基本无。然后22度诱导11h后沉淀中没有目的蛋白，上清中少，但比之前要多。这是不是说明，我应该在37度和22度之间摸条件呢？还有我听说低iptg有助于降低包涵体，但是为何我觉得1mM的好像比0.1mM和0.02mM的好像上清中要多一点呢
还有就是，如果大体积诱导，多少升细菌液合适呢？
问题比较多，谢谢各位啦
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生物-医药
1楼 2016-01-19 14:38:14
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a2703521

金虫 (小有名气)

123

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
dllchina: 金币+1, 鼓励交流 2016-01-21 11:47:31
22℃诱导11h时间有点短了，最好过夜，15h以上应该可以。诱导剂用量最好别太多，不然容易出现包涵体，根据情况可以适当调整一下。
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梦的金色城堡
5楼2016-01-20 16:43:53
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a2703521

金虫 (小有名气)

123
引用回帖:
6楼: Originally posted by 梦的金色城堡 at 2016-01-21 14:28:22
我又做了26度30度过夜的，比较看，觉得22度0.5mM好像多一点，我打算用20度大体积诱导纯化，做完就可以回家啦，所以这一次挺重要的，你说的过夜是多少小时呢？如果我20度诱导的话，你觉得诱导剂浓度0.5合适不？时间 ...

20℃诱导，过夜一般超过15h就可以了，如果蛋白稳定性好的话可以适当延长时间，不过最好不要超过20h，不然很容易溶菌，而且氨苄抗性的菌种超过20h还容易长杂菌，会影响蛋白的质量和产量。0.5的诱导剂用量差不多了，如果条件可以的话也可以做几个梯度的浓度做比较。
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梦的金色城堡
8楼2016-01-22 12:04:15
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a2703521

金虫 (小有名气)

123
引用回帖:
7楼: Originally posted by 梦的金色城堡 at 2016-01-21 14:35:38
哦哦，刚注意你说的时间。再请问一下，his标签的，过柱的话，像我这种上清中蛋白少的，洗脱液15ml会不会出来的蛋白浓度就小，需要减少洗脱液的量吗
...

如果蛋白浓度低，可以想办法浓缩的，关键是洗脱液的用量能保证最大量的洗脱目标蛋白。
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9楼2016-01-22 12:05:35
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a2703521

金虫 (小有名气)

123
引用回帖:
11楼: Originally posted by 梦的金色城堡 at 2016-01-25 15:36:53
多谢啦，结果出来了，20度，0.4mM诱导剂16h，过柱后用了8ml洗脱液，第二天本来打算处理柱子，又加了5ml洗脱液，发现还有目的蛋白，浓度都不多，有些弱杂带，不过对我来说也算不错啦，开学再做时就用洗脱液多孵育时 ...

不用客气，以后多交流交流，互相学习！
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12楼2016-01-26 15:02:34
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