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yby_ybh007

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于重组质粒的问题

最近在做双元载体的构建，载体是PBI101-ProIQM4-IQM4-GFP，已经连接转入到大肠杆菌DH5α中，涂布后有菌生长，挑单菌落进行菌落pcr并转板，一共做了3次pcr的验证，每次都有转板，pcr的引物分别是①ProIQM4的引物、②IQM4的前向引物和GFP的反向引物、③ProIQM4的前向引物和IQM4的反向引物，pcr都有阳性对照（用ProIQM4-IQM4-GFP的质粒），pcr验证后就进行摇菌提质粒，发现质粒非常难提取出来，我用的是takara的试剂盒，后来提取了一次质粒浓度大约50ng/ul的，进行了单酶切和双酶切以及pcr验证（pcr是质粒稀释50倍后加了1ul），pcr做了两组引物（引物①和引物②），电泳跑胶后（1%的胶）单酶切和双酶切只有marker有条带，样品没有任何条带，①引物有非常亮的特异性条带，②引物只有marker有条带。于是跑了一下质粒，用了5ul，同样没有任何条带。感觉好像质粒浓度的问题，于是重新摇菌提质粒，这次质粒浓度有65ng/ul，同样做了相同的验证，但是这次所有验证都没有任何条带，除了marker，这到底是什么问题，是我做连接转化的时候没做好吗？还是其他地方出了问题了，感受态转化后的pcr验证也是一步一步来的，也做好了标记，确定是有特异性条带才往下做的。在提质粒那方面，因为实在没有太好的方法，我采取了多管菌液离心后加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，过同一个柱子的，难道这样是不行的？求各位大神帮忙，指点一下小弟啊！！！
附上一张提取质粒后测的浓度！A260/A280好像偏大了，这个地方有问题吗？

关于重组质粒的问题


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1楼 2016-01-16 22:17:19
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fudan671

木虫 (著名写手)
质粒浓度提高

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4楼2016-02-27 21:39:31
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黄宇良

新虫 (小有名气)
你好  解决了么  我也是跑了好几次了  重组质粒一直没条带

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2楼2016-02-27 19:03:35
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jackyoung

新虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-02-28 10:12:52
原因还是质粒浓度太低，那个载体太大，按照分子量计算你切出的条带的量更少，所以达不到凝胶上观察的量。而一旦真实存在，通过PCR的方式是可以检测到的。认真地给你说一句，质粒提取试剂盒弄出来的量偏小，一旦洗脱不当，产量更少。手提吧，我们谈笑间手提质粒几十管，感觉就是民工…

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CestLaVie
3楼2016-02-27 19:52:05
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黄宇良

新虫 (小有名气)
你好  解决了么  我也遇到了同样的问题  一直跑不出条带  双酶切也没条带  没法继续做表达了

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5楼2016-03-07 08:22:41
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