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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 关于重组载体鉴定
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wuxchao

木虫 (小有名气)

[交流] 关于重组载体鉴定

各位分子虫友，最近在做一个干扰载体构建，当目的片段连接后通过PCR测序结果显示条带大小无差（设置了原始载体的对照）但送去测序结果测不出来，请问是什么原因呢？
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1楼 2015-12-31 08:39:52
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看沉思录

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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wuxchao: 金币+1 2015-12-31 09:13:18
wuxchao: 金币+2 2016-04-05 14:57:26
（通过PCR测序结果显示条带大小无差异）这句话我可以理解为菌落PCR结果阳性或者是质粒双酶切结果条带是预计是一致的？
分析：
1.菌落PCR结果不一定准确，送测序你是送其中的一个还是几个？建议考虑多送几个测序。
2.酶切换酶双酶切作进一步确定。其他结果也无误时送两个测序。
3.测序结果测不出来是具体是什么意思？测序公司说无结果？让他们给你可能的原因。
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QQ 2644862520承接整体课题服务，包括课题设计、实验实施、论文服务
2楼2015-12-31 08:45:59
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wuxchao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 看沉思录 at 2015-12-31 08:45:59
（通过PCR测序结果显示条带大小无差异）这句话我可以理解为菌落PCR结果阳性或者是质粒双酶切结果条带是预计是一致的？
分析：
1.菌落PCR结果不一定准确，送测序你是送其中的一个还是几个？建议考虑多送几个测序。 ...

PCR结果为菌落PCR的结果，测序了八个样，模板正常，均是无信号。
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3楼2015-12-31 09:09:40
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看沉思录

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶切验证下，弄一组连接用的两个酶切位点；弄一组其他的位点，酶切结果看下是怎么样的
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QQ 2644862520承接整体课题服务，包括课题设计、实验实施、论文服务
4楼2015-12-31 10:58:27
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liuxinyueer

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
wuxchao: 金币+1 2015-12-31 15:30:12
一般做了菌落PCR后，若有目的条带，还要提质粒做酶切，最后才测序。若送去测序给质粒浓度太低，可能测不出来。
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欢迎讨论，小木虫未能及时回复，请邮箱: lmzhang1994@gmail.com
5楼2015-12-31 13:09:30
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wuxchao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liuxinyueer at 2015-12-31 13:09:30
一般做了菌落PCR后，若有目的条带，还要提质粒做酶切，最后才测序。若送去测序给质粒浓度太低，可能测不出来。

质粒都抽提了，也做了鉴定，今天也问了测序，那边也说不出什么所以然来！引物是自己根据载体序列设计的！

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6楼2015-12-31 13:52:00
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siriusxuan

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
wuxchao: 金币+1 2015-12-31 15:30:23
wuxchao: 金币+1 2016-04-05 14:57:54
干扰载体一般指的是shRNA表达载体吧，由于反向互补序列的存在，测序时候用U6或者离目标序列太近都会造成序列中断或者无信号现象，我最近测得就是这样，只能看到前面十几个碱基。
公司推荐以后再来测，备注上 困难模板，他们会采用特殊方案进行测序。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
7楼2015-12-31 15:02:53
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wuxchao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-12-31 15:02:53
干扰载体一般指的是shRNA表达载体吧，由于反向互补序列的存在，测序时候用U6或者离目标序列太近都会造成序列中断或者无信号现象，我最近测得就是这样，只能看到前面十几个碱基。
公司推荐以后再来测，备注上 困难模 ...

是的，我用的是PTCK303，在插入第一个片段后测序始终无信号

发自小木虫Android客户端
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8楼2015-12-31 15:14:50
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siriusxuan

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by wuxchao at 2015-12-31 15:14:50
是的，我用的是PTCK303，在插入第一个片段后测序始终无信号
...

送GENWIZ去试试，他们有这种特殊解决方案。
别的地方，我在生工也测出来过。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
9楼2015-12-31 15:24:58
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oh0987

铁杆木虫 (职业作家)
555555555555
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密码密码红
10楼2015-12-31 15:25:47
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