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wuxchao

木虫 (小有名气)

[交流] 关于重组载体鉴定

各位分子虫友,最近在做一个干扰载体构建,当目的片段连接后通过PCR测序结果显示条带大小无差(设置了原始载体的对照)但送去测序结果测不出来,请问是什么原因呢?
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看沉思录

铁虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
wuxchao: 金币+1 2015-12-31 09:13:18
wuxchao: 金币+2 2016-04-05 14:57:26
(通过PCR测序结果显示条带大小无差异)这句话我可以理解为菌落PCR结果阳性或者是质粒双酶切结果条带是预计是一致的?
分析:
1.菌落PCR结果不一定准确,送测序你是送其中的一个还是几个?建议考虑多送几个测序。
2.酶切换酶双酶切作进一步确定。其他结果也无误时送两个测序。
3.测序结果测不出来是具体是什么意思?测序公司说无结果?让他们给你可能的原因。
QQ 2644862520承接整体课题服务,包括课题设计、实验实施、论文服务
2楼2015-12-31 08:45:59
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wuxchao

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 看沉思录 at 2015-12-31 08:45:59
(通过PCR测序结果显示条带大小无差异)这句话我可以理解为菌落PCR结果阳性或者是质粒双酶切结果条带是预计是一致的?
分析:
1.菌落PCR结果不一定准确,送测序你是送其中的一个还是几个?建议考虑多送几个测序。 ...

PCR结果为菌落PCR的结果,测序了八个样,模板正常,均是无信号。
3楼2015-12-31 09:09:40
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看沉思录

铁虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
酶切验证下,弄一组连接用的两个酶切位点;弄一组其他的位点,酶切结果看下是怎么样的
QQ 2644862520承接整体课题服务,包括课题设计、实验实施、论文服务
4楼2015-12-31 10:58:27
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liuxinyueer

木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
wuxchao: 金币+1 2015-12-31 15:30:12
一般做了菌落PCR后,若有目的条带,还要提质粒做酶切,最后才测序。若送去测序给质粒浓度太低,可能测不出来。
欢迎讨论,小木虫未能及时回复,请邮箱: lmzhang1994@gmail.com
5楼2015-12-31 13:09:30
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wuxchao

木虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by liuxinyueer at 2015-12-31 13:09:30
一般做了菌落PCR后,若有目的条带,还要提质粒做酶切,最后才测序。若送去测序给质粒浓度太低,可能测不出来。

质粒都抽提了,也做了鉴定,今天也问了测序,那边也说不出什么所以然来!引物是自己根据载体序列设计的!

发自小木虫Android客户端
6楼2015-12-31 13:52:00
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
wuxchao: 金币+1 2015-12-31 15:30:23
wuxchao: 金币+1 2016-04-05 14:57:54
干扰载体一般指的是shRNA表达载体吧,由于反向互补序列的存在,测序时候用U6或者离目标序列太近都会造成序列中断或者无信号现象,我最近测得就是这样,只能看到前面十几个碱基。
公司推荐以后再来测,备注上 困难模板,他们会采用特殊方案进行测序。
此座可言轻社稷,江山万里起风尘。
7楼2015-12-31 15:02:53
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wuxchao

木虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by siriusxuan at 2015-12-31 15:02:53
干扰载体一般指的是shRNA表达载体吧,由于反向互补序列的存在,测序时候用U6或者离目标序列太近都会造成序列中断或者无信号现象,我最近测得就是这样,只能看到前面十几个碱基。
公司推荐以后再来测,备注上 困难模 ...

是的,我用的是PTCK303,在插入第一个片段后测序始终无信号

发自小木虫Android客户端
8楼2015-12-31 15:14:50
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siriusxuan

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by wuxchao at 2015-12-31 15:14:50
是的,我用的是PTCK303,在插入第一个片段后测序始终无信号
...

送GENWIZ去试试,他们有这种特殊解决方案。
别的地方,我在生工也测出来过。
此座可言轻社稷,江山万里起风尘。
9楼2015-12-31 15:24:58
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oh0987

铁杆木虫 (职业作家)

555555555555
密码密码红
10楼2015-12-31 15:25:47
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