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mvan

新虫 (初入文坛)

[求助] 如何确定测序结果是否为目的片段？ 已有1人参与

新新手一枚，求助大家如何确定测序结果是否为目的片段?
我用的通用引物没有在我研究的物种中被使用过，近缘种中也没有人使用过。可用来对比的参考序列都是其它目或同目不同科的物种的序列，对比后相似度在80%以下。
在NCBI上blast之后，和同属另一物种相似度为84%。（同属另一物种序列长度是我的两倍，所以肯定也不是同一个引物。）
不知道这种情况怎么确定目的片段呢？还请各位轻拍
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1楼 2015-11-11 20:09:12
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-11-11 22:57:32
首先，你的目的条带在NCBI上比对出来其他近缘物种的片段长度是否差不多？同时，预测出你的编码蛋白，同样去ＮＣＢＩ比对，看多肽链长度的差异。如果差不多长，就说明可能是正确的，序列间的差异来自物种间的差异。如果明显地跟其他物种比较差异较大，说明未拿到正确序列，可能还要继续延长你的片段。具体是不是你需要的片段，如果没有参考基因组，就只能通过拿到更多的测序信息来确定你的序列是否正确了。
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2楼2015-11-11 20:32:50
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mvan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-11-11 20:32:50
首先，你的目的条带在NCBI上比对出来其他近缘物种的片段长度是否差不多？同时，预测出你的编码蛋白，同样去ＮＣＢＩ比对，看多肽链长度的差异。如果差不多长，就说明可能是正确的，序列间的差异来自物种间的差异。如 ...

文献里引物扩增产物应该在700左右，我扩增出来的产物在680左右。我用的引物没有近缘种用，NCBI上比对出来的那个近缘种序列全长1500左右，并且没有在文章中发表，所以我不能确定近缘种的引物。而我能用来比对的参考序列（即引物相同），是亲缘关系很远的物种（同目不同科或不同目）
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3楼2015-11-11 21:06:15
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晞朔

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mvan at 2015-11-11 21:06:15
文献里引物扩增产物应该在700左右，我扩增出来的产物在680左右。我用的引物没有近缘种用，NCBI上比对出来的那个近缘种序列全长1500左右，并且没有在文章中发表，所以我不能确定近缘种的引物。而我能用来比对的参考 ...

没有基因组就很难确定你扩增的片段是否具有完整的功能。需要对功能进行验证。
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4楼2015-11-11 21:53:43
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mvan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-11-11 21:53:43
没有基因组就很难确定你扩增的片段是否具有完整的功能。需要对功能进行验证。...

我不太明白功能验证，能说具体一点吗？是把DNA序列翻译成蛋白序列，然后再比对吗？这时候怎么选参考序列呢？
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5楼2015-11-11 22:22:16
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