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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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斯多格格

铜虫 (小有名气)

[求助] 确定漆酶基因的问题

我做的是酵母单杂,目的是筛选漆酶poxc的反式作用因子,当时听一个小老师的话,直接在NCBI上找到漆酶的poxc全序列,设计引物扩增得到起始密码子上游193bp作为顺势作用元件序列进行构建诱饵质粒,现在我的质粒已经构建好了,进入建库阶段。郁闷的是,前段时间导师把我的课题给他原来的学生看,那个学生在日本读博士,刚毕业,她就是我的实验涉及存在很大的缺陷,我没有拿到我自己所用菌株的漆酶基因全序列,如何确定启动子,这根本就说不通,我问她说,我根据网上的序列设计引物扩增出三千多的全序列进行测序可以吗?她说不行,也没告诉我怎么办,后来我看实验室有师姐用染色体步移得到全基因序列的,就问小老师要不要这样做,小老师很恼火,人家已经有全序列了,你不放心就设计引物扩增出来测测序嘛,干嘛要用步移?然而导师对这个海外博士非常信任,一致问我这个课题,我能说什么啊,都是他们决定我该怎么做,我当时就是觉得应该应该把启动子序列克隆出来,然后连到一个基因上确定是否真的具有表达功能,然后最好再做做缺失分析,找到顺式作用元件之后在做酵母单杂,当时小老师就说,我不理解他的意思,把精力放在别的地方,不做关键的。后来我就向他屈服了,按他说的做,到现在师姐出来质疑。实验已经进行到这一步了,就是按师姐说的重新开始也来不及了,试剂盒加上一些东西都快花了2万元了,并且试剂盒必须用,要不就过期了,我很被动,导师问时,意见只能偏向小老师一路走到黑,我该怎么办?希望大家提提建议,知道的帮忙分析下我这样做的可能结果,不知道的就建议一下我该如何处理这件事吧,谢谢大家了!
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书自香我何须花
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robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-08-13 15:02:01
斯多格格: 金币+5, 有帮助, 谢谢,我当时是对整个网上公布的启动子前面的序列进行softberry搜索,它是一个顺式作用元件数据库,发现这段序列的顺式作用元件很多,就选取了它,没有进行实验验证 2012-08-14 10:57:19
感觉是存在很大问题。你如何判断这193bp就是反式作用因子的结合位点?应该先判断大概位置或区域。可以利用不同长度的启动子区域序列启动gus,检测gus酶活性,找出影响最大的那一段,可能就是反式作用因子的结合位点所在区域。个人看法,仅供参考。其实只需要重新构建载体即可,不需要重新建库,花费不了多少钱。
2楼2012-08-13 10:08:28
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baby1987

金虫 (小有名气)

小丹木木: 应助指数-1, 交流,不算应助哦 2012-08-31 15:56:52
不知道你实验最后成功了没,反正我觉得实验室乱的很,上面的都不统一意见,那我们这些小喽喽当炮灰,红了是他们的,黑了就是我们的事,好无奈啊,你说的这个我也要做,能不能发一下相关的文献给我啊?
加油。
3楼2012-08-31 10:57:30
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