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斯多格格铜虫 (小有名气)
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[求助]
确定漆酶基因的问题
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| 我做的是酵母单杂，目的是筛选漆酶poxc的反式作用因子，当时听一个小老师的话，直接在NCBI上找到漆酶的poxc全序列，设计引物扩增得到起始密码子上游193bp作为顺势作用元件序列进行构建诱饵质粒，现在我的质粒已经构建好了，进入建库阶段。郁闷的是，前段时间导师把我的课题给他原来的学生看，那个学生在日本读博士，刚毕业，她就是我的实验涉及存在很大的缺陷，我没有拿到我自己所用菌株的漆酶基因全序列，如何确定启动子，这根本就说不通，我问她说，我根据网上的序列设计引物扩增出三千多的全序列进行测序可以吗？她说不行，也没告诉我怎么办，后来我看实验室有师姐用染色体步移得到全基因序列的，就问小老师要不要这样做，小老师很恼火，人家已经有全序列了，你不放心就设计引物扩增出来测测序嘛，干嘛要用步移？然而导师对这个海外博士非常信任，一致问我这个课题，我能说什么啊，都是他们决定我该怎么做，我当时就是觉得应该应该把启动子序列克隆出来，然后连到一个基因上确定是否真的具有表达功能，然后最好再做做缺失分析，找到顺式作用元件之后在做酵母单杂，当时小老师就说，我不理解他的意思，把精力放在别的地方，不做关键的。后来我就向他屈服了，按他说的做，到现在师姐出来质疑。实验已经进行到这一步了，就是按师姐说的重新开始也来不及了，试剂盒加上一些东西都快花了2万元了，并且试剂盒必须用，要不就过期了，我很被动，导师问时，意见只能偏向小老师一路走到黑，我该怎么办？希望大家提提建议，知道的帮忙分析下我这样做的可能结果，不知道的就建议一下我该如何处理这件事吧，谢谢大家了！ |
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baby1987
金虫 (小有名气)
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3楼2012-08-31 10:57:30
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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-08-13 15:02:01
斯多格格: 金币+5, ★有帮助, 谢谢，我当时是对整个网上公布的启动子前面的序列进行softberry搜索，它是一个顺式作用元件数据库，发现这段序列的顺式作用元件很多，就选取了它，没有进行实验验证 2012-08-14 10:57:19
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| 感觉是存在很大问题。你如何判断这193bp就是反式作用因子的结合位点？应该先判断大概位置或区域。可以利用不同长度的启动子区域序列启动gus，检测gus酶活性，找出影响最大的那一段，可能就是反式作用因子的结合位点所在区域。个人看法，仅供参考。其实只需要重新构建载体即可，不需要重新建库，花费不了多少钱。 |
2楼2012-08-13 10:08:28
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