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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » cDNA模板PCR弥散带
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济云帆

新虫 (初入文坛)

[求助] cDNA模板PCR弥散带 已有1人参与

现在用的是cDNA为模板，SRAP 的引物，扩增。做了好几天都没有条带。而是弥散条带。反转录用的RevertAid first strand cDNA synthesis kit. RNA检测没问题。A260/280 在2左右。
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1楼 2015-10-27 19:41:38
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兽医做科研

金虫 (小有名气)
你好，最近我也在做cDNA，我想请教一下，cDNA做模板进行pcr扩增的时候，cDNA加多少量
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2楼2015-10-27 20:37:59
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yangchun0
引用回帖:
2楼: Originally posted by 兽医做科研 at 2015-10-27 20:37:59
你好，最近我也在做cDNA，我想请教一下，cDNA做模板进行pcr扩增的时候，cDNA加多少量

1ul

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3楼2015-10-27 23:35:05
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济云帆

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 兽医做科研 at 2015-10-27 20:37:59
你好，最近我也在做cDNA，我想请教一下，cDNA做模板进行pcr扩增的时候，cDNA加多少量

我一般是测了浓度，稀释成20ng/ul。原来能P出来的时候。大概浓度在100ng/20ul。

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4楼2015-10-28 06:32:36
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兽医做科研

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 济云帆 at 2015-10-28 06:32:36
我一般是测了浓度，稀释成20ng/ul。原来能P出来的时候。大概浓度在100ng/20ul。
...

我觉得cDNA不好测浓度啊，体系里面的试剂比较多，我也是加了1微升，只是个别泳道跑出了很浅的条带，我也很郁闷
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5楼2015-10-28 17:21:08
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兽医做科研

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yangchun0 at 2015-10-27 23:35:05
1ul
...

嗯，我就是加了1ul
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6楼2015-10-28 17:54:24
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骆驼人

金虫 (正式写手)
我一般反转录时10微体系RNA量加1ug，之后稀释8-10倍，利用内参基因检测一下，再进行后续实验。反转录的盒子也比较重要

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愿你，温柔又坚定，不轻易许诺但许的诺一定会实现，有勇气有力量，会发现一切美好的事物
7楼2015-10-28 19:37:26
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济云帆

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 骆驼人 at 2015-10-28 19:37:26
我一般反转录时10微体系RNA量加1ug，之后稀释8-10倍，利用内参基因检测一下，再进行后续实验。反转录的盒子也比较重要

我今天换了模板，换了酶，还是弥散条带。是不是引物有问题

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8楼2015-10-28 22:57:02
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Romaner007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-30 21:27:23
应该是引物，退火温度问题！可以适当的提高退火温度试试
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人的一切都应该是美丽的！
9楼2015-10-30 12:26:14
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济云帆

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Romaner007 at 2015-10-30 12:26:14
应该是引物，退火温度问题！可以适当的提高退火温度试试

提高了了退火温度。还是不行

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10楼2015-10-30 23:24:58
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