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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用组织提取总RNA后逆转录得到的cDNA进行PCR一直未有目的条带，请大家帮忙！
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东乐乐

金虫 (初入文坛)

[求助] 用组织提取总RNA后逆转录得到的cDNA进行PCR一直未有目的条带，请大家帮忙！ 已有3人参与

我打算做质粒构建，但是第一步PCR就进行不下去了。采集新鲜组织后立即用Trizol法提取RNA，用takara的逆转录试剂盒得到的cDNA，用师兄师姐留下的引物进行PCR可以扩增出相应大小的目的条带（约1500bp），但用我自己设计的几对引物都不能扩增出条带（目的条带大小：3564bp），只有最下面有疑似引物二聚体的条带，其余的一条带也没有。我想要获得该基因的CDS全长，之后进行细胞转染。选的酶切位点和载体都是实验室里现有的。实验新手有很多不懂的，请大家帮我想想办法，谢谢大家！

克隆载体：19T【T-Vector pMD19(Simple)】
表达载体：pEGFP-N1

引物：（其它引物跟这个差不多就是上下几个碱基的增减）
上游：5‘-CCCAAGCTTGCCACCATGCCTTTTGGTCTGAAGCTC-3‘[Hind III酶切位点，我引入了Kozak序列(GCCACC序列)，据说这样有利于以后的表达]
下游：5’-CCGGAATTCTTAAATGAGTCTGGAGTTTTGGAGG-3’(EcoR I酶切位点)

体系：共25μl
高压过的纯水 16μl
10X LA PCR Buffer II (Mg2+ plus) 2.5μl
dNTP Mix 2μl
引物上游、下游各1μl
cDNA模板 2μl
Takara LA Taq 0.5μl

条件：35个循环
94℃ 2min（3min也做过）
94℃ 30s
55℃（58℃和61℃也做过）1min
72℃ 4min
72℃ 10min
4℃  ∞

CDS序列：共3564bp
ATGCCTTTTGGTCTGAAGCTCCGCCGGACACGGCGCTACAACGTCCTGAGCAAGAACTGCTTTGTCACACGGATTCGCCTGCTGGACAGCAATGTTATCGAGTGCACGCTGTCGGTGGAAAGCACAGGGCAAGAATGCCTGGAGGCTGTGGCCCAGAGGCTGGAGCTGCGAGAGACGCACTACTTTGGCCTTTGGTTTCTCAGCAAGAGCCAGCAAGCACGATGGGTGGAGCTGGAGAAACCTCTGAAGAAACATCTGGACAAATTCGCTAATGAGCCTTTGCTTTTCTTTGGAGTCATGTTCTATGTGCCAAATGTGTCATGGCTTCAGCAAGAGGCCACAAGATATCAGTATTACCTGCAAGTCAAAAAAGATGTGCTTGAAGGGCGATTACGATGTACATTGGACCAGGTGATTCGGCTAGCCGGCCTAGCTGTGCAAGCTGATTTTGGAGACTATAATCAGTTTGATTCTCAAGATTTCCTCAGAGAGTATGTGCTATTTCCTATGGATTTGGCCCTGGAAGAGGCTGTTCTGGAGGAGCTGACCCAGAAGGTAGCCCAAGAACACAAAGCCCACAGTGGAATCCTGCCAGCAGAAGCTGAACTGATGTACATCAATGAAGTTGAACGTTTGGATGGATTTGGACAGGAAATCTTCCCTGTAAAGGACAATCATGGAAACTGTGTACACCTTGGCATTTTCTTTATGGGGATTTTCGTGAGGAACAGAATTGGAAGACAAGCGGTAATATACAGGTGGAATGACATGGGGAATATCACTCATAACAAGTCGACCATTCTAGTGGAGCTCATCAACAAAGAAGAGACTGCCCTCTTTCACACGGATGATATCGAAAATGCCAAGTATATTTCTCGGTTGTTTGCCACACGACACAAGTTTTACAAACAAAACAAAATCTGCACTGAACAGTCAAATTCTCCACCCCCCATCAGACGCCAGCCCACCTGGAGCCGATCCTCTCTGCCCAGGCAGCAGCCGTACATCCTGCCTCCCGTTCACGTCCAGTGTGGTGAGCACTACTCGGAAACGCACACCTCGCAAGACAGCATTTTTCATGGGAATGAAGAAGCCTTGTATTGCAACTCTCACAACAGCCTGGACTTAAATTATTTAAATGGCACTGTCACCAATGGCAGCGTGTGTAGCGTTCACAGCGTCAACTCCCTCAACTGCTCGCAAAGTTTCATCCAGGCCTCCCCTGTATCCTCCAACCTCAGTATCCCTGGGAGTGACATCATGCGGGCCGACTACATCCCGAGCCACCGGCACAGCGCGATCATCGTGCCCTCGTACAGGCCAACCCCCGATTATGAGACAGTCATGCGCCAGATGAAGAGGGGGATCCTGCATACAGACAGCCAGAGCCAGTCTCTGAGAAACCTCAACATTATCAACACCCATGCCTACAACCAGCCAGAGGATCTGGTGTACAGCCAACCGGAGATGCGGGAGAGGCACCCCTACACTGTCCCTTATGGGCCACAGGGGGTCTACAGCAACAAACTTGTCAGTCCATCTGACCAGAGGAACCCAAAGAATAATGTGGTACCAAGCAAGCCGGGGGCAAGCGCCATCTCGCACACGGTGAGCACCCCAGAGCTGGCCAACATGCAGCTGCAGGGCAGCCATAACTACAGCACGGCCCACATGCTTAAGAACTATCTCTTCAGGCCACCGCCCCCCTACCCACGGCCACGACCTGCCACCAGCACCCCAGACCTGGCCAGCCACCGCCACAAGTACGTCAGCGGCAGCAGCCCGGACCTGGTGACCCGGAAGGTGCAGCTCTCGGTGAAGACCTTCCAAGAGGACAGCTCTCCGGTGGTTCATCAGTCTCTCCAGGAGGTGAGCGAGCCCCTCACGGCCACCAAGCACCACGGCACTGTGAACAAGCGCCACAGCCTGGAGGTGATGAACAGCATGGTGCGGGGCATGGAGGCCATGACGCTCAAGTCGCTCCACCTCCCCATGGCTCGCCGCAACACGCTCCGGGAGCAGGGACCGCCCGAGGAGGGGTCAGGCAGCCACGAGGTCCCCCAGCTCCCTCAGTATCACCACAAGAAGACCTTCTCTGATGCCACTATGCTAATCCACAGCAGCGAGAGTGAGGAGGAGGAGGAGGAGGCTCCAGAATCGGTGCCCCAGATCCCCATGCTCCGGGAGAAGATGGAGTACAGTGCCCAGCTGCAGGCGGCCCTGGCCCGCATCCCCAACAAGCCCCCGCCTGAGTACCCCGGTCCAAGGAAGAGTGTGAGCAATGGGGCTCTGAGGCAGGACCAAGCCAGCCTTCCTCCCGCCATGGCCAGAGCCAGGGTGCTGAGGCATGGGCCAGCCAAGGCCATCAGCATGTCTCGGACTGACCCGCCGGCTGTCAACGGGGCCTCTCTCGGCCCATCCATCTCGGAACCCGACCTGACTAGTGTGAAGGAGCGGGTCAAAAAAGAGCCTGTGAAGGAGAGACCTGTGTCTGAAATGTTTTCCCTGGAAGACAGCATTATAGAGAGAGAGATGATGATCAGGAATCTAGAGAAGCAGAAGATGGCAGGCCTGGAGGCACAGAAGAGGCCGCTGATGTTGGCAGCATTGAATGGGCTCTCGGTGGCTCGAGTCTCAGGGCGGGAAGAGAATCGAGTTGATGCCACCCGGGTTCCCATGGACGAGAGGTTCAGAACCCTGAAGAAGAAACTAGAAGAGGGAATGGTGTTCACAGAATATGAGCAAATTCCAAAGAAAAAGGCGAATGGCATTTTCAGCACAGCAGCTCTGCCAGAAAACGCCGAGCGCAGCCGAATCCGTGAAGTTGTCCCCTATGAGGAGAATCGAGTAGAGCTGATACCAACCAAAGAAAATAACACAGGATACATTAATGCCTCCCACATCAAGGTGGTGGTTGGCGGGGCAGAATGGCACTACATAGCCACCCAGGGGCCCCTGCCACACACGTGCCACGACTTCTGGCAGATGGTGTGGGAGCAGGGAGTGAATGTGATTGCCATGGTCACTGCAGAGGAGGAGGGTGGACGAACCAAAAGCCACCGATACTGGCCCAAACTAGGTTCAAAGCACAGCTCAGCCACCTATGGCAAGTTCAAGGTCACCACGAAGTTTCGAACGGATTCTGTTTGCTATGCAACCACGGGCTTGAAGGTCAAGCACCTTTTGTCTGGGCAAGAAAGGACGGTGTGGCATTTACAATATACTGACTGGCCAGATCACGGCTGTCCAGAAGATGTCCAAGGATTTTTATCCTACTTGGAGGAGATCCAGTCGGTCCGTCGCCATACCAACAGCATGCTGGAAGGCACCAAGAACCGGCACCCGCCCATCGTGGTCCACTGTAGTGCTGGGGTGGGAAGGACCGGCGTGCTCATTCTTTCTGAGCTGATGATCTACTGCTTGGAACATAACGAAAAGGTGGAAGTGCCCATGATGCTGAGGCTCCTCAGGGAGCAGAGGATGTTCATGATCCAGACTATCGCTCAGTACAAGTTTGTCTACCAAGTCCTCATCCAGTTCCTCCAAAACTCCAGACTCATTTAA


总的mRNA序列：其中654bp至4217bp为CDS区域
ACTCGCACGGCCCCTTCCTCCCTCCTCTCCCGGCCGCTCGCATTTCCTGCCGCTCTGGCTCTCCCGGCCCCTCAAAGTTCTTTCCAACTTTTTCTCGGCGGAGTGAGCGCAGCGGGCGCAGACTCGGGGGCAGGTTGCTGTGCTTCTCCGGGCTCAGCCGCCTGCTCTCCTGGCTCAGGTCCTCGGGGAGCCCTAGACAGACATCAAGTGGCCACTGGCGCTCCTTCCCCTCCCAGCTGAGCCATCCTCCCCGGCCTCCTCGGGCGGGACAGCCCCGTGCTTAGGTTTTTCTCCTTTTCTCCCCCGGTGCGCCTCTGCTCGGACTCTCGCGCCGGGATCGCGGCGGAAACCTCCCTCCCCTTTCGCCTCCTGCGGCTCCTTCCCTTCGCCCCTCCTCCGCCAGTCACTGGAATCAATTCCGTGGGGAATCGGCTCCGCCGCCGCGAAGGACAGCCTTTCCGCGCGGGACTCCGGGGCGCCACGGGGGCCATGTAAGCAGCTATCTTCCAGAGGGCCACACTGGGCATGGACACCCTTTTCCCTGCCTGGAGGAGCACAGGTGATAGTGTAATTTTCCAGTCACGAAACTGCTAAGGCCATCTCAGGGGCGTGTGCGCCAGGATAGGCGGGCGGCGTCCGAGGACCACATAGCCATGCCTTTTGGTCTGAAGCTCCGCCGGACACGGCGCTACAACGTCCTGAGCAAGAACTGCTTTGTCACACGGATTCGCCTGCTGGACAGCAATGTTATCGAGTGCACGCTGTCGGTGGAAAGCACAGGGCAAGAATGCCTGGAGGCTGTGGCCCAGAGGCTGGAGCTGCGAGAGACGCACTACTTTGGCCTTTGGTTTCTCAGCAAGAGCCAGCAAGCACGATGGGTGGAGCTGGAGAAACCTCTGAAGAAACATCTGGACAAATTCGCTAATGAGCCTTTGCTTTTCTTTGGAGTCATGTTCTATGTGCCAAATGTGTCATGGCTTCAGCAAGAGGCCACAAGATATCAGTATTACCTGCAAGTCAAAAAAGATGTGCTTGAAGGGCGATTACGATGTACATTGGACCAGGTGATTCGGCTAGCCGGCCTAGCTGTGCAAGCTGATTTTGGAGACTATAATCAGTTTGATTCTCAAGATTTCCTCAGAGAGTATGTGCTATTTCCTATGGATTTGGCCCTGGAAGAGGCTGTTCTGGAGGAGCTGACCCAGAAGGTAGCCCAAGAACACAAAGCCCACAGTGGAATCCTGCCAGCAGAAGCTGAACTGATGTACATCAATGAAGTTGAACGTTTGGATGGATTTGGACAGGAAATCTTCCCTGTAAAGGACAATCATGGAAACTGTGTACACCTTGGCATTTTCTTTATGGGGATTTTCGTGAGGAACAGAATTGGAAGACAAGCGGTAATATACAGGTGGAATGACATGGGGAATATCACTCATAACAAGTCGACCATTCTAGTGGAGCTCATCAACAAAGAAGAGACTGCCCTCTTTCACACGGATGATATCGAAAATGCCAAGTATATTTCTCGGTTGTTTGCCACACGACACAAGTTTTACAAACAAAACAAAATCTGCACTGAACAGTCAAATTCTCCACCCCCCATCAGACGCCAGCCCACCTGGAGCCGATCCTCTCTGCCCAGGCAGCAGCCGTACATCCTGCCTCCCGTTCACGTCCAGTGTGGTGAGCACTACTCGGAAACGCACACCTCGCAAGACAGCATTTTTCATGGGAATGAAGAAGCCTTGTATTGCAACTCTCACAACAGCCTGGACTTAAATTATTTAAATGGCACTGTCACCAATGGCAGCGTGTGTAGCGTTCACAGCGTCAACTCCCTCAACTGCTCGCAAAGTTTCATCCAGGCCTCCCCTGTATCCTCCAACCTCAGTATCCCTGGGAGTGACATCATGCGGGCCGACTACATCCCGAGCCACCGGCACAGCGCGATCATCGTGCCCTCGTACAGGCCAACCCCCGATTATGAGACAGTCATGCGCCAGATGAAGAGGGGGATCCTGCATACAGACAGCCAGAGCCAGTCTCTGAGAAACCTCAACATTATCAACACCCATGCCTACAACCAGCCAGAGGATCTGGTGTACAGCCAACCGGAGATGCGGGAGAGGCACCCCTACACTGTCCCTTATGGGCCACAGGGGGTCTACAGCAACAAACTTGTCAGTCCATCTGACCAGAGGAACCCAAAGAATAATGTGGTACCAAGCAAGCCGGGGGCAAGCGCCATCTCGCACACGGTGAGCACCCCAGAGCTGGCCAACATGCAGCTGCAGGGCAGCCATAACTACAGCACGGCCCACATGCTTAAGAACTATCTCTTCAGGCCACCGCCCCCCTACCCACGGCCACGACCTGCCACCAGCACCCCAGACCTGGCCAGCCACCGCCACAAGTACGTCAGCGGCAGCAGCCCGGACCTGGTGACCCGGAAGGTGCAGCTCTCGGTGAAGACCTTCCAAGAGGACAGCTCTCCGGTGGTTCATCAGTCTCTCCAGGAGGTGAGCGAGCCCCTCACGGCCACCAAGCACCACGGCACTGTGAACAAGCGCCACAGCCTGGAGGTGATGAACAGCATGGTGCGGGGCATGGAGGCCATGACGCTCAAGTCGCTCCACCTCCCCATGGCTCGCCGCAACACGCTCCGGGAGCAGGGACCGCCCGAGGAGGGGTCAGGCAGCCACGAGGTCCCCCAGCTCCCTCAGTATCACCACAAGAAGACCTTCTCTGATGCCACTATGCTAATCCACAGCAGCGAGAGTGAGGAGGAGGAGGAGGAGGCTCCAGAATCGGTGCCCCAGATCCCCATGCTCCGGGAGAAGATGGAGTACAGTGCCCAGCTGCAGGCGGCCCTGGCCCGCATCCCCAACAAGCCCCCGCCTGAGTACCCCGGTCCAAGGAAGAGTGTGAGCAATGGGGCTCTGAGGCAGGACCAAGCCAGCCTTCCTCCCGCCATGGCCAGAGCCAGGGTGCTGAGGCATGGGCCAGCCAAGGCCATCAGCATGTCTCGGACTGACCCGCCGGCTGTCAACGGGGCCTCTCTCGGCCCATCCATCTCGGAACCCGACCTGACTAGTGTGAAGGAGCGGGTCAAAAAAGAGCCTGTGAAGGAGAGACCTGTGTCTGAAATGTTTTCCCTGGAAGACAGCATTATAGAGAGAGAGATGATGATCAGGAATCTAGAGAAGCAGAAGATGGCAGGCCTGGAGGCACAGAAGAGGCCGCTGATGTTGGCAGCATTGAATGGGCTCTCGGTGGCTCGAGTCTCAGGGCGGGAAGAGAATCGAGTTGATGCCACCCGGGTTCCCATGGACGAGAGGTTCAGAACCCTGAAGAAGAAACTAGAAGAGGGAATGGTGTTCACAGAATATGAGCAAATTCCAAAGAAAAAGGCGAATGGCATTTTCAGCACAGCAGCTCTGCCAGAAAACGCCGAGCGCAGCCGAATCCGTGAAGTTGTCCCCTATGAGGAGAATCGAGTAGAGCTGATACCAACCAAAGAAAATAACACAGGATACATTAATGCCTCCCACATCAAGGTGGTGGTTGGCGGGGCAGAATGGCACTACATAGCCACCCAGGGGCCCCTGCCACACACGTGCCACGACTTCTGGCAGATGGTGTGGGAGCAGGGAGTGAATGTGATTGCCATGGTCACTGCAGAGGAGGAGGGTGGACGAACCAAAAGCCACCGATACTGGCCCAAACTAGGTTCAAAGCACAGCTCAGCCACCTATGGCAAGTTCAAGGTCACCACGAAGTTTCGAACGGATTCTGTTTGCTATGCAACCACGGGCTTGAAGGTCAAGCACCTTTTGTCTGGGCAAGAAAGGACGGTGTGGCATTTACAATATACTGACTGGCCAGATCACGGCTGTCCAGAAGATGTCCAAGGATTTTTATCCTACTTGGAGGAGATCCAGTCGGTCCGTCGCCATACCAACAGCATGCTGGAAGGCACCAAGAACCGGCACCCGCCCATCGTGGTCCACTGTAGTGCTGGGGTGGGAAGGACCGGCGTGCTCATTCTTTCTGAGCTGATGATCTACTGCTTGGAACATAACGAAAAGGTGGAAGTGCCCATGATGCTGAGGCTCCTCAGGGAGCAGAGGATGTTCATGATCCAGACTATCGCTCAGTACAAGTTTGTCTACCAAGTCCTCATCCAGTTCCTCCAAAACTCCAGACTCATTTAATCACCCCAATCCAGCTCCTGGAGGAGGGACCCAGCTCCATCGCGCTGGAGGAGAGTCACCTCCAGACAACATCTGCTCCCCCCACAGGGGTGCAGGTGGCTGGCAGCAAACAGGCTCTCTGAAGACAGTAGCCAAGATTATTCACACATACCATGTATTATTTTATATGAGATAATTTATTTTTTTCCCCTTTGGAATAACTTTTGTGAATTATTATAATGCAGTTTCCCTAGTAATATAGTACTTTTCATTTGAACCACATCTTGACTGATCTGTATTGTAATATATGTCAGCAGGTAAGGTTGCCTGCTGGATCATTTTGAGGACAGAGGCATGAGGGAGCACATCTCTTGTGAAGTTGCAGCCAGATTTGTAACCAACCCTGAAATTCATCAGCTTAATTCATTTATCAGCTTGATTCATTCATCATTCATTGCTTATATCCAAAGCAAAGACGGTAAGAAAATGAATTCATCCTGAAATATAAAGAAAAGGGTCTGAAGGAACAAACACGATTCTCTTATATTTTGGGGCTCATGAGCCTTGATAGACAGTTTCCTCTCGTCTTCATTTCCACCCCTCATCCTCAGTAGTCTCCTCTCCCCCACGCCCCACCCCAACTTCCCCCCCAAGCTTGAGTTAAAGACAGAATAGCTAAAGACAGTGCTGCCTTTACAATGCAGTAATTGCCATCTTTGGGGCCGAAAGACAAGCTCTGTGTTGTGCTTTTCTTGACCACCCCTTATCCTGGGCTCTGGAGCTTGTGTTTCCCTGCTGGCGACTGTACCTTGGGTATTTGTTGCTACCTCTCCTGTTTGCTCAGTAGGACCCTGTCTGGTGGCATTGAGGCTCTGGACCAGACCATCTGTGCAGTTAAGGCTCTACCCTGATTGAGAGAGGATAGCAGACCTAGAAAGAGAAAGGAGTTGGGCAGGGCCTTTGAGGATTGTGTTTTTCAGGCAGGGCCTTGATGATCATTGTTTTTTATTTAAATAAGATGTGTGTGCTGGACAGAGACCTAAAAGTTGAGGTCACTAAGTCATTGGAAAGGCCATCAAGGAAACAGATGGGGAAGCTGATTTATGGGAGCTGTAAGGCATTTAGCTACATAACAGGGGTCCTGGCCAGGAAACACATCAAATGTGACCCCCGCTGTGCTGATATCATCTTCAGGCTTTGGTCTGCAAGATCAGAATTAATCCCACTCGGGACCCCATAGTCCAAACTTGGGGCCACTTGATGAACGATGGTAGAATTGTCATTGGCAGAGCCCTGTGCTTCTTTCCTTTTCTTCATAAAATCCACTCGCTGGTCAGTTATCTTCACTTTGAAGCCCAGTTCTTAGTTTCTTCCTATGGCTTCATTGGTCAGTGTCCTTCTGAATTTCCAAGGATGGTACACAATAAATCATGTTTTGTACTTTTTTCCTCTTACTGCATTTTGGGGGATTTATCATTCTATGTCTACCTTTTCTTGAGTACAGCTTTGATATGCACCTGTTGTTACGTGGTGATGGGAAGTCACAGGCGTGCTCTTTCTAGTTAATTTGATGCCACATCTTCCTTGTCTTTTCAGCTTGGGAAAAAGGCGGCAGTGGAGGAAGGCATGGAATGCCCACAGTGGTCAGTTCAAAGAACAAACGTGCAATTAAAAAACTGTAGTCAGCCAGGCACGGTGGTTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGAAAGGCCAAGGCGGGCAGATTGCTTGAGCTAAGGAGTTCGAGACCAGCCTGAGCAACATGATGAAACCCCGTCTCTACAAAAAGTACAAAAATTAGCCAGGCGTGGTGGTATGCCCTGGTAGTCCCAGCTGCTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGGATCACCTGATTCTAAGAATTCGAGACTGCAGTGAGCCGTGATCTTGCCACTGTAGTCCAGGCTGGGCTACGGAGAGACCCTGCCTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGAAAAAAGGTTGTCAAGAAAAACTAGATGTTAGGAGAAAGGAAAATTTAATTGCAGTTTTTTTTCTTAGAATTGACTGCTGTGAGAGTTCCATATGCCTTTCTTCATTGCTGCTTTTGTCCCCCGTGAGCTAAAAAGATGGAGTGACATCAAATCAACCAGAAAAAGTATGCCTTTGTGACATCCCATCACCACATGCCAACAGGTATATATTCCCCATTAAGTTCTTCGGAATAGGAATCCTCTGTTTCAACCTGGCCAGGTGTTGTGGTGGCTGTACTCTAGTTAGACTCGGAATATCTGGGGATGGAGGGCTTCCCCTGTGTCTTCTACTTCAAGGTCTGAAGGCTCAGTGAAGGAGTATAATCTGCTGATCTTTGTAGATTCTGGAGTTTTGTTGTATGTCCTGGAAAGAAACCCATTAGTATTACATGTATTTTCAGTGAACAGAGCTTATAACCCTTATTATAAGAAGCTCATCAATAAGCAAAAAGATACTTGTTTCCTTTCCTTGGAGGTTTTTCCATCCTTGGGATATTCTGCTGTTAGGGATGTTTTAGCAAGTGGTCTCAGTTACTGGTTTATTGCGTGATGAACAACATCAGTATTTATCTTTTATCTCTAAGCCCCAAGGTGGGCACTGTTAGAATATGTCTCATGTGGACAGCATATAGATCTGGTGCGTCTTTGAGGTCGTCAGAGCTCATGGGCTTCCCTGAAATTCATCCACTGTCCCTGCCGTATGCTACGGGAATATTCATTAGTGTACAAAATGCAGGGAGGAAGTAGGTTTAATATTCAACTTTCTAGCCAAAGTTTATATTGAAACCCAAAAGAAAACATTTAAGAGTTGTTCCACATATTTCACTTTTAAAAACAAATGCCTTTGGTTCTTTAGCACATTTTGCATTCCTTTTCACATCTCCAGTAAATGCCAACATATCTCCTGTTAAATTAGCAGCAGCCATTTAAAGTCCTTTCGGTGGCATCTGCATAATAATTGCCCAGAGATGCTTTATATCTGGGAAGCAAGCCAAGGAATAAACCTTGAAGCAAAGTGTATTAAATTAGTTATCTAGTTAGAGCTTTTGGAATGATTTCCTGATGATGTATCAAGTCTGAAGCTGGAGCTGTCAGTGTCTATTGCTGCAGTTTGGATTTGAAGGGAGAAAATGTAAAATGGAGGAAAAAAAAGTTACCATCTCACAACAAAGCCATCAAACATTTTCCAGCCGCTGTTTTCGAGGTTTTCCAGTTGAACTGTTTGGTTTCTTTCATCCACACTCATTTGGATACATTGACCCGAGGTATTCATCCTTGTTTACTGTGGTCCCTGAATCATGGGGGCTGAATTTGATGTCTTCATCCTTGAGATGAGCCTGCTGGCTTAGCTGAGGAATGTCCTGCTGAGGTTTCTTAGGTTTCCTTGGGTTCTAAGGATATACTGGATATACCATCTTTTAGCAAGAGTATCTGGTAGCATTTACAGATAGCATAGACATTGGTATGCACTTCTTTCCCCAGATAGGAAGTAAAGGAGGATTTAGTTGCATGAAAAAAGGATGTTAAACATTGATTACATAGGAGTAAAGATGAATGAGCTGCAATATTCAGTCGGAGCTAAACAATAAGATCAGGGAAGGTAAAAATACCTATGTGGAATATTTTGAATCGTAAGCTTTTGAGGAGCTTAAATTGAGAGAATTTTACTTTTAATTTTGTAGATTGAGAAGAGGAACCGCTTTTTAAAATTATAGCTAAACTGTCATTGTTTTCCTAAGAGTCACTTGGCCATCTCTGGCCCCCTCTTTCATCAGCCTGAAGAGAGGGTCTTTGTAGACTGCTGAGGGTGGGCCTTGTAGGACTTGACCATGGCTTACACCTACTTAACCTTTATCCTGCTTTCTTTCAGCTTGTGCTTTTCAGTTATAAACTCCAGTGGGTACAGCAGGCTGGCCTTTTCATCCAGCTGATTATTTTTCCAGCTTAATATAGATTGACCCATATGAAATTTCCAATAATGGACCATATTTTCTGCAAATAGACAGTACTCGCATGGATCACCTATATCTTCCCCCTGATACACTGTGGGTCCCAACACCAGATGTCATTTCTCCAGAGCAGTGCTAATGAACACAAAAGGTATACCCTGGGTGGCCCAGCTCTTTTCACGAACGTGCTGCCCTGCTCATAGTGATCCTTGCATCACTTGGTGAATGGGCCATCTCCTGGGACATGGAAGTTGCAGAGGTAGATAGTGCACTGCAGCTTCTCTTAAGCCGGATTGGCCATCAGGCATATCACTCTGGAGTTTTTAGCTGCTGTCCTTTCCCGATGAACAGTCTGTATTAGCTGACCTCAGCCTACTTGTTACGTGACGTATGGGTCCCAAAAGTGTCCTTTGTCAAAAAGCAGAATGTGCCTTCTAGTCTCCCTTTCCCCATCTAATGGTGTATTCGATGGTGAAGATGAGTACAGTTGACCACCCCTATCTGTGGGTTCCACATCCCTATATTCAACCAAGTACAGATTGAAAAATATTTGGGGAAGAGGGGAAACCCACAAAGTTCCAAAAAGCAAAAGTTGAATTTGCCACATGCTGAATACTACATTGAATTCACACAAATGAAGTGATGTGTAGGCATTGAGTTAGGTATTGTAAATAATCTAGAGATGATTTAAAGTATGCAAGAGATGTGCATAGGTTATATGCAAATACTGTGCTATTTTATATAAAAGACTTGAACATCCATGGATTCTGGTATTCTCAGAGGGTCCTTGATTGCCCCCTTTGGTAAAGGACAACTATTTCGTTACTGATTTTCGTTTGGGGAAGATCTGTCAATCCCTTGAGGTGCGGGGGTTGGGGGGATGGAGGGTACAGGGCATTCTAGGATGTGTGCCAGGGAGCACAGATTCAAGGGATGGGATTGAGTCAGACCTGTGTTCTTACTCAGTGTCAGAAATAACTCTGTGGAGCTCCTAGAGTAAGACATTTCCGGAAGCACCACATAATTACTGTTGGGCTCTTAGGGTAGCCCTTTTAGGGAATTGAGCATTCCCATGTTTTACCAACAATTATTCTGCTGCTGTGTTTTATTATATTGCCAATGGTTTTGAGACACTCATCATGCTCTTATTTAGTGATTTCTTTTCATGAGCAGAGCAACAGCTCATCCAGCATGGTTTCCAAATGGAGAAATTTGGGTCTTCTGTAGAAACCACACAAATTCTCCAATGGCCTACAGCCTTATGGTTGGCACACTAGTTGGCCCTATAGGGTGGAAATAAAGCTGTAAGATGTTAAACTGCATTTGATACTTCTCTTGAACGCTGAGCAAGGAAGCAAAATAGTTCTTGTCTTTACTTAAGCTTCTAAGACATTTTGGGGCAAAGGACCTTACAGATGGCGTCTGTTGAAAGTAACAGCAACGTGCCAGGGAGAAATGTGGGGGAAATCTCATCAAATTCTGCCACCTCAAATGTGTTGTCCAGAAGTCAGTGTTATTCAGGGGGCCCTGTGAAACTTGACCACCAGCTTGCGCCATCAACACTCAGCCTTTATCCAGCCTGCTCTCAGCTTTTGTGTTTCTGTTAGAAACTCAGATAGGTAAGTATTTTTATTCAGTAGACTACCTTTCTTATCTTTTCAGCTTAATATAGCTGCATCTTCTTTCTCAAAGCCAAACTAAGATATTCTCTATTAAAATGTCCATGAGCCTAGCATTGAGTGTCTGGCATCCATCAATTTCATAGACTGGAAAATGATTGTTGTTTGGTACAGTAAAGAAGAGGATGTGCATCAGTTCCTACCGTTTGCA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1楼 2015-10-16 13:30:29
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liping121200

铜虫 (小有名气)

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你的目的条带太长了，一般情况下PCR扩增的最大片段就是3kb，你需要想其他办法了，用扩长片段的long taq酶或者做分段克隆做拼接了
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东乐乐
好好学习，天天向上
2楼2015-10-16 15:45:27
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东乐乐

金虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by liping121200 at 2015-10-16 15:45:27
你的目的条带太长了，一般情况下PCR扩增的最大片段就是3kb，你需要想其他办法了，用扩长片段的long taq酶或者做分段克隆做拼接了

谢谢你的回答，请问如果做分段克隆的话有什么好的建议吗？例如酶的推荐和引物设计的经验能分享一下么？因为没有接触过分段克隆，请多多指教！
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3楼2015-10-19 09:05:11
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秉秉的法兰西

新虫 (小有名气)
我们一般会先p个内参看看，先确定cdna没问题

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4楼2015-10-19 12:02:43
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秉秉的法兰西

新虫 (小有名气)
我当年也是三千多的片段，很弱，我用kod fx酶，保证性高，p了两管收集到一起胶回收的，然后二次pcr，不过takara的反转试剂盒的保证性不是特别高，我曾经遇到过突变的情况

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东乐乐
5楼2015-10-19 12:07:31
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iayala

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你好，你的问题确实有点让你头疼。我尝试着分析一下：
1. RNA有没有断掉，跑胶看看条带大小对不对验证一下；
2. 模板GC含量是否过高，考虑是否要加DMSO;
3. 尝试槽式PCR，即设计一对儿引物，其扩增片段大小为CDS两端各延伸一定长度，如200bp，然后用该引物的扩增产物作为模板，再用CDS引物扩增。
4.至于你用的酶，看说明书，看能否扩增4kb的片段，一般地，应该没有问题的。

祝您好运！
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东乐乐
6楼2015-10-19 12:10:37
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tolobio

新虫 (小有名气)
商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
太长了。很难转录出这么大量完整的cDNA。还是分成几段吧。1kb一段，分别PCR，然后再通过无缝拼接的方法克隆到一起。
建议这种体力活还是送到公司来做比较省事。这样可以省下不少时间来看文献，设计实验。
如果需要的话，欢迎咨询tolobio@126.com
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东乐乐
7楼2015-10-19 12:21:37
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

目的片段太长了，超过3Kb就算P出来也容易发生部分位点突变，这种情况还是建议分段PCR，然后连接，这种原理就是利用粘性末端连接的，每段的引物都设计的带一点下一段的前5-10个碱基
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东乐乐
医学&统计学
8楼2015-10-19 17:43:42
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sunqx

木虫 (著名写手)
问题很多，做好每一步，再做下一步

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9楼2015-10-19 17:55:18
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xianglixie3

铜虫 (小有名气)
我也是～要哭了

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10楼2015-10-19 18:29:46
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