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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 新手请教关于总RNA提取以及琼脂糖凝胶电泳的问题！
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Mercy_

新虫 (初入文坛)

[求助] 新手请教关于总RNA提取以及琼脂糖凝胶电泳的问题！ 已有2人参与

各位站友们大家好，我在做苜蓿草chs基因的克隆实验，第一次接触克隆实验，在提取总RNA以及电泳验证其完整性的时候出了很大的问题，提了四天了，每次跑出来的胶都像下面的样子......询问了师兄和师姐，他们因为没做过RNA的实验所以也不太清楚，小弟在此请教各位大侠了！
        RNA长度大约是1.2Kbp
        下面是我们的实验过程：

总RNA提取：

1.取新鲜的苜蓿草嫩叶分ABCD四组，每组80mg，经1 g·L?1 次氯酸钠消毒15 min 后, 用双蒸水冲洗干净, 放置-20℃冰箱保存过夜
2.实验用研钵用0.1%DEPC水冲洗，放-20℃冰箱预冷
3.实验用烧杯、镊子、刮刀、枪头、EP管在0.1%DEPC溶液中浸泡过夜，第二天放在37℃的烘箱中烘干。（实验室只有37℃烘箱......）
4.组织样本提取：每个样品加三平勺石英砂，用研钵将组织在-20摄氏度冰箱中磨成粉末，四个样品分别加1ml Trizol，放置5分钟
5.每组加0.2ml氯仿，震荡15秒，室温静置2分钟；4摄氏度，12000转离心15分钟（配平用石英砂）
6.取水相于新的离心管，加0.5ml异丙醇，室温放置10分钟；4摄氏度，12000转离心10分钟（配平用异丙醇）
7.弃去上清液，加入1.5ml的75%乙醇，涡旋；4摄氏度，12000转离心5分钟（配平用 75%乙醇）
8.弃去上清液，室温干燥7分钟；将RNA溶于10μL的0.1%DEPC水中，-60℃保存过夜

注：所有试剂均用0.1%DEPC水配制，操作过程戴手套和口罩。每次提完总RNA，EP管底部都有很少的白色沉淀，用0.1%DEPC水可以溶解。

RNA跑胶：

1.将制胶用具用75%乙醇冲洗一遍，晾干备用。
2.电泳槽处理：3%H2O2灌满，室温放置10分钟，0.1%DEPC水冲洗。
3.制胶：称取0.4g琼脂糖粉末，加入放有29.2mL的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入4mL的5xTBE、6.8mL的甲醛，2.5μl Goldview然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。
4.加样：在一个DEPC处理过的，干燥的EP管中混合以下试剂：5xTBE2μl、甲醛3.5μL、甲酰胺10μL、RNA样品3.5μl。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。取6μL加样于凝胶点样孔内。
5.打开电泳仪，100V电泳30分钟
6.电泳结束后通过紫外透视仪观察。

然后跑出来一直都是这样的......今天下午借了学长PCR完了多余的DNA（长度大约为750bp），按照完全一样的电泳条件，和我们提取的放-60℃过夜的RNA一同电泳，结果还是什么都没看到，这到底是总RNA提取有问题呢还是琼脂糖凝胶电泳的问题呢？希望大侠们不吝赐教！

新手请教关于总RNA提取以及琼脂糖凝胶电泳的问题！
10000407533376.jpg
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1楼 2015-07-17 17:48:07
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Mercy_

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by seeker91 at 2015-07-17 18:37:11
胶图可以看出，没有提取出来核酸，是核酸，DNA RNA 都没有
劝你用试剂盒提吧，如果苜蓿是高酚高糖的，还得用专用试剂盒
电泳必须点MARKER
RNA提取的结果应该是如下图片才可以http://muchong.com/bbs/viewthread.ph ...

可我不太明白的是为什么DNA的条带也没跑出来呢？是电泳条件不对么？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2015-07-18 08:32:43
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seeker91

木虫 (文坛精英)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Mercy_ at 2015-07-18 08:32:43
可我不太明白的是为什么DNA的条带也没跑出来呢？是电泳条件不对么？
...

你用一个试剂盒什么都明白了，我回答了你一个问题，你会有很多问题又冒出来，真的，做实验就这样。
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5楼2015-07-18 14:43:07
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普通回帖

seeker91

木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-18 13:02:10
Mercy_: 金币+5, ★有帮助 2015-07-19 14:19:08
胶图可以看出，没有提取出来核酸，是核酸，DNA RNA 都没有
劝你用试剂盒提吧，如果苜蓿是高酚高糖的，还得用专用试剂盒
电泳必须点MARKER
RNA提取的结果应该是如下图片才可以
新手请教关于总RNA提取以及琼脂糖凝胶电泳的问题！-1
RNA电泳图
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1520113
2楼2015-07-17 18:37:11
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ppppppppp

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Mercy_: 金币+5, ★有帮助 2015-07-19 14:18:32
引用回帖:
3楼: Originally posted by Mercy_ at 2015-07-18 08:32:43
可我不太明白的是为什么DNA的条带也没跑出来呢？是电泳条件不对么？
...

是液氮研磨和裂解不充分的问题。要狠狠地磨才行
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1520113
初来乍到，请多指教
4楼2015-07-18 11:44:39
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Mercy_

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ppppppppp at 2015-07-18 11:44:39
是液氮研磨和裂解不充分的问题。要狠狠地磨才行...

实验室里没有液氮，师兄说他们以前在研钵里加石英砂，放在-20℃冰柜里研磨也能提出DNA来，是不是因为RNA不稳定所以同样的条件提不出来么？
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6楼2015-07-18 14:45:11
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Mercy_

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by seeker91 at 2015-07-18 14:43:07
你用一个试剂盒什么都明白了，我回答了你一个问题，你会有很多问题又冒出来，真的，做实验就这样。...

谢谢！准备向指导老师要个试剂盒试试了，确实会有很多问题......刚接触分子生物学实验，慢慢熟悉操作
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7楼2015-07-18 14:49:15
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ppppppppp

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Mercy_ at 2015-07-18 14:45:11
实验室里没有液氮，师兄说他们以前在研钵里加石英砂，放在-20℃冰柜里研磨也能提出DNA来，是不是因为RNA不稳定所以同样的条件提不出来么？...

-20度研磨效果没有液氮好，加了石英砂效果好点。如果要用RNA做后续试验，建议去弄点液氮来，我们实验室也没有，但是学校有，可以去用热水瓶打液氮的。

师兄说能提出来DNA，那你就先试试看吧，要狠狠地磨，磨成粉。。。。
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初来乍到，请多指教
8楼2015-07-21 12:17:06
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sandycool

铁虫 (正式写手)
研钵要蒸馏水洗完，烘干，高压灭菌，烘干，180度烘3-4小时；最好液氮研磨

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9楼2015-10-24 11:05:47
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铿锵爪神

金虫 (正式写手)
亲溶解RNA的DEPC水高压灭菌了么？

发自小木虫Android客户端
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10楼2015-10-31 19:53:41
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