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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用组织提取总RNA后逆转录得到的cDNA进行PCR一直未有目的条带，请大家帮忙！
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liping121200

铜虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by 东乐乐 at 2015-10-19 09:05:11
谢谢你的回答，请问如果做分段克隆的话有什么好的建议吗？例如酶的推荐和引物设计的经验能分享一下么？因为没有接触过分段克隆，请多多指教！...

这个我们实验室大师兄做的比较多，我知道要这么做，具体的你查查网上的资料吧，我看还挺多的
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好好学习，天天向上
11楼2015-10-20 10:57:16
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liping121200

铜虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by 东乐乐 at 2015-10-19 09:05:11
谢谢你的回答，请问如果做分段克隆的话有什么好的建议吗？例如酶的推荐和引物设计的经验能分享一下么？因为没有接触过分段克隆，请多多指教！...

这是我查到的，感觉蛮好，你看一下，真的要分段，在中间找个酶切位点分成两段就好了，每段一千多，也就可以了。再多了实在没意义，后面还麻烦。注意这个酶切位点必须是在这2800bp中只有一个，而且在酶切位点前后设计引物比较容易。

比如说，EcoRI吧，那么P出来的结果是 5'- XXX......GAATTCXXX，和XXXGAATTCXX.....XXX -3'，然后酶切链接测序去吧。
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东乐乐
好好学习，天天向上
12楼2015-10-20 11:02:17
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东乐乐

金虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by 秉秉的法兰西 at 2015-10-19 12:07:31
我当年也是三千多的片段，很弱，我用kod fx酶，保证性高，p了两管收集到一起胶回收的，然后二次pcr，不过takara的反转试剂盒的保证性不是特别高，我曾经遇到过突变的情况
...

感谢回答！请问逆转录试剂盒有什么好的推荐么？
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13楼2015-10-21 08:50:04
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东乐乐

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6楼: Originally posted by iayala at 2015-10-19 12:10:37
你好，你的问题确实有点让你头疼。我尝试着分析一下：
1. RNA有没有断掉，跑胶看看条带大小对不对验证一下；
2. 模板GC含量是否过高，考虑是否要加DMSO;
3. 尝试槽式PCR，即设计一对儿引物，其扩增片段大小为CDS ...

非常感谢！
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14楼2015-10-21 08:50:51
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东乐乐

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7楼: Originally posted by tolobio at 2015-10-19 12:21:37
太长了。很难转录出这么大量完整的cDNA。还是分成几段吧。1kb一段，分别PCR，然后再通过无缝拼接的方法克隆到一起。
建议这种体力活还是送到公司来做比较省事。这样可以省下不少时间来看文献，设计实验。
如果需要 ...

非常感谢！
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15楼2015-10-21 08:51:31
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东乐乐

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8楼: Originally posted by 董博士 at 2015-10-19 17:43:42
目的片段太长了，超过3Kb就算P出来也容易发生部分位点突变，这种情况还是建议分段PCR，然后连接，这种原理就是利用粘性末端连接的，每段的引物都设计的带一点下一段的前5-10个碱基

非常感谢！
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16楼2015-10-21 08:52:03
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东乐乐

金虫 (初入文坛)
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12楼: Originally posted by liping121200 at 2015-10-20 11:02:17
这是我查到的，感觉蛮好，你看一下，真的要分段，在中间找个酶切位点分成两段就好了，每段一千多，也就可以了。再多了实在没意义，后面还麻烦。注意这个酶切位点必须是在这2800bp中只有一个，而且在酶切位点前后设 ...

好的，谢谢，我试试看
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17楼2015-10-21 08:53:45
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hikewell

新虫 (初入文坛)
海克维尔简介：
海克维尔基因（北京）研究院是一家专业从事生物科学、转化医学及肿瘤早期诊断研究的科研服务机构；目前研究院建立了基于基因组学及细胞组学为主的系统生物学平台，配备了包括PacBioRSII 三代测序仪、Affymetrix 高通量基因芯片、Leica 白激光共聚焦显微镜、PE 高内涵成像系统在内的领先仪器，可对外进行基因诊断、生化免疫检测、大数据分析等服务，为公众提供癌症和糖尿病的早期辅助诊断与筛查及慢病精准化大健康管理服务。
第三代测序平台简介-单分子实时测序

PacBio RS II 测序平台介绍
PacBio RS II是Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time, SMRT）。在测序历史上首次实现了人类观测单个DNA聚合酶合成过程的梦想。使研究者第一次能够利用单个 DNA 聚合酶对天然DNA 的合成进行大规模平行的、连续的实时观察。它让科学家能够快速经济地完成基因组组装、揭示并了解表观基因组，以及鉴定基因组变异，是基因组从头测序的最佳选择。
PacBio RS II系统的读长为业内最长，能够达到深度覆盖且精确度高。利用最新的试剂，PacBio RS II的平均读取长度可达10 kb-15 kb，且每个SMRT cell能产生500 Mb-1 Gb的数据。在准确度方面，SMRT DNA测序可以实现超过99.999%（QV50）的高度精确测序，且不受DNA序列中GC和AT含量的影响。这些特点让用户可以获得完整的序列变异类型，检测单核苷酸多态性和复杂的结构变异，以及此前无法检测到的基因组区域。此外，SMRT测序技术也是目前唯一一个可以跨越完整基因序列和染色体单倍体型直接检测碱基修饰和鉴定变异信息的技术。
PacBio RS II 测序系统服务领域
  基因组测序
(1) 由于具有读长长的特点，SMRT测序平台在基因组测序中能降低测序后的Contig数量，明显减少后续的基因组拼接和注释的工作量，节省大量的时间。
(2) Pacbio RSII系统提供长片段读长全面解读基因组的复杂度，包括稀有SNP，缺失，结构变异和单倍体等。
长片段读长对这些应用必不可少，对有变异的序列如果仅有短片段的读序会由于定位错误或定位不明确而无法确定真实的变异，甚至得出错误结果。此外，短片段读序也无法测定大片段的结构变异的准确位置，大小及等位序列。
  细菌基因组完成图
(1) 普通细菌快速完成图构建；
(2) 尤其适合超高GC/超低GC细菌；
(3) 其它用传统方法测序比较困难细菌菌株。
该平台是目前唯一能完成完整基因组组装，结构测定和基因分型的微生物测序平台。实际应用中，大家普遍用PacBio序列拼Contig，再用Illumina的序列来修正碱基，从而将PacBio长读长数据和二代测序短读长数据进行混合拼接完成基因组。
  从头组装（DE Novo Assembly）
该平台是目前唯一能完成完整基因组组装，结构测定和基因分型的微生物测序平台。因为读长很长，所以在拼Contig时，成功率很高，可以拼出很长的Contig。并且可以轻松跨过重复序列、高GC序列，实现序列覆盖的完整性和均一性。。
  修饰碱基测定
DNA碱基修饰，例如DNA甲基化，是基因表达，宿主-病原反应，DNA损伤和修复等许多重要生命过程中的关键因素。与其他技术相比，PacBio RSII系统能够实时观测到每个单核苷酸的添加，在测序过程中同时检测碱基集合的动力学信息，从而直接测定不同碱基，不同基团的多种修饰。
  RNA测序
单分子测序技术最大的优势，也是最直接的应用就是检测细胞和组织内基因表达水平，同时对基因的结构做出分析，如RNA的剪接，是否有碱基突变或异常表达基因等。
  HLA分型
人体器官移植中，准确的HLA分型很重要。HLA是一个长片段，而且单体型对配型成功、移植成功有重要意义。现在医学上正在尝试用PacBio的序列来为HLA准确分型提供解决方案。
PacBio RS II 测序系统优势
完成基因组测序、靶向测序、二代测序数据混合拼接、修饰碱基测序、转录组分析等的最佳选择。
   无以伦比的读长；
   没有GC偏好；
   操作流程简便；
   更精细的测序；
   数据分析方便；
   独有的动力学信息；
PacBio RS II 测序数据分析服务
针对PacBio RS II 测序数据我们提供数据分析服务，其中包括原始数据的一级、二级及三级分析，可以根据客户需求及研究方向，制定“个性化”的数据分析服务。
联系我们
联系人：王翠芳  王秋艳
联系电话：010-61824292     010-61824285     18510608628
电子邮箱：wqy_hikewell@163.com
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18楼2015-10-21 09:09:20
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jkyy1314

金虫 (初入文坛)
感觉引物设计的不大好，CG含量有些好，就算P出来，特异性也不会好，CG含量保持在55%以下为宜，还有目的产物确实太长，我们实验室也就做几百b的，也是宝生物试剂盒，效果很好。

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东乐乐
19楼2015-10-21 09:11:47
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zgb1982

木虫 (正式写手)
太长了，很难扩

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20楼2015-10-21 09:16:23
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