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RNA提取的细节
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RNA 真不好提取，这是我在网上看到的，和大家共享！！ 对大部分实验人员来说，RNA 抽提比基因组 DNA 抽提要困难得多。事实上，现有的 RNA 抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提 RNA，比抽提基因组 DNA 更方便，成功率也更高。那为什么同样的方法用于组织 RNA 的抽提，总会碰到问题呢？ 组织 RNA 抽提失败的两大现象是： RNA 降解和组织内杂质的残留。关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解。现有的 RNA 抽提试剂，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其 RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的 RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此，假定有一种办法，在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的 Rnase 降解 RNA 的速度快。电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎 100% 能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物，取相应部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白质。 究竟怎样才能确保 RNA 抽提的成功率呢？实验前选择合适的方法/试剂，这是最重要的一步；好的方法/试剂在确保成功的同时，操作方便，经济实用。当然，您的选择可能仍然有问题，这就需要能正确分析实验失败的原因，以便改进。 |
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2012-05-12 17:57:03, 25.03 K
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