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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重组质粒转化后提的平板有很多菌落，但是菌落PCR 没有结果。
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LeonardoChen

金虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒转化后提的平板有很多菌落，但是菌落PCR 没有结果。 已有3人参与

重组质粒PET28a，转化到大肠杆菌（BL21），涂布到平板，37℃，培养14h左右，单菌落数有很多然后随机挑取10单菌落，加入50微升无菌水，煮沸40min，做菌落PCR，第一次pcr体系是：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7引物 ，1微升T7Terminator  ，86微升无菌水。分装每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，进行PCR，跑胶结果显示有阳性克隆，但是测序结果显示都是假阳性。
第二次尝试用另一种方法：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7Terminator  ，1微升引物R（就是自己刚开始做克隆设计的引物） ，86微升无菌水。分装每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，进行PCR，跑胶结果显示都没有阳性克隆。
PCR反应条件：95℃ 5min，Sample Text   72℃ 10min，4.0℃ pause

各位能不能帮我分析下，为什么单菌落那么多却没有阳性克隆，如果是实验操作的原因最可能会出现在哪一步？谢谢，不甚感激！
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1楼 2015-09-27 14:05:59
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高gaoeryang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

从你的描述来看，第一次用载体上引物进行菌落PCR验证，出现阳性克隆，但测序不对；第二次用载体和片段的引物，未出现阳性克隆。
一般来讲，质粒转BL21成功率很高，你得到了较多的转化子，转化应该是没有问题的。
可以绕过菌落PCR验证，选择4~10个转化子进行酶切验证，因为菌落PCR假阳性较高
一定要菌落PCR的话用你的第二次方法，多挑点转化子，一次做30个，嘿嘿

还有从你的描述上看你才做了一次转化，也可以再重复一次看看
再给你个经验，尽量挑取菌落小的克隆子，分散着挑别扎堆

这个都是模式化的操作，没问题的，再试试呗
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5楼2015-10-12 17:24:09
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MMCCBB

新虫 (著名写手)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-12 13:40:24
你先测序看重组质粒是否正确，有可能是载体自连

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2楼2015-09-27 22:59:35
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飞龙在天605

禁虫 (初入文坛)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-12 13:40:31
本帖内容被屏蔽
3楼2015-10-12 13:19:54
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赵鑫易

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

lz你就不能用Taq mix吗省时省力
菌落PCR不用煮沸，pcr的时候94°多变性5min基本就好了

回答：重组质粒是什么，是刚连接上的还是提的。
一般是构建表达载体（t4连接之类），连接产物转化到DH5a或top10，然后挑克隆菌落培养同时pcr检测，提质粒酶切检测，都没问题再去测序，测序没问题再转到BL21
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4楼2015-10-12 14:01:02
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