应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重组质粒转化后提的平板有很多菌落，但是菌落PCR 没有结果。
51/1返回列表
查看: 1523  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

LeonardoChen

金虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒转化后提的平板有很多菌落，但是菌落PCR 没有结果。 已有3人参与

重组质粒PET28a，转化到大肠杆菌（BL21），涂布到平板，37℃，培养14h左右，单菌落数有很多然后随机挑取10单菌落，加入50微升无菌水，煮沸40min，做菌落PCR，第一次pcr体系是：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7引物 ，1微升T7Terminator  ，86微升无菌水。分装每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，进行PCR，跑胶结果显示有阳性克隆，但是测序结果显示都是假阳性。
第二次尝试用另一种方法：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7Terminator  ，1微升引物R（就是自己刚开始做克隆设计的引物） ，86微升无菌水。分装每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，进行PCR，跑胶结果显示都没有阳性克隆。
PCR反应条件：95℃ 5min，Sample Text   72℃ 10min，4.0℃ pause

各位能不能帮我分析下，为什么单菌落那么多却没有阳性克隆，如果是实验操作的原因最可能会出现在哪一步？谢谢，不甚感激！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-09-27 14:05:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

赵鑫易

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

lz你就不能用Taq mix吗省时省力
菌落PCR不用煮沸，pcr的时候94°多变性5min基本就好了

回答：重组质粒是什么，是刚连接上的还是提的。
一般是构建表达载体（t4连接之类），连接产物转化到DH5a或top10，然后挑克隆菌落培养同时pcr检测，提质粒酶切检测，都没问题再去测序，测序没问题再转到BL21
赞一下 回复此楼
4楼2015-10-12 14:01:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答

MMCCBB

新虫 (著名写手)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-12 13:40:24
你先测序看重组质粒是否正确，有可能是载体自连

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
2楼2015-09-27 22:59:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飞龙在天605

禁虫 (初入文坛)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-12 13:40:31
本帖内容被屏蔽
3楼2015-10-12 13:19:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

高gaoeryang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

从你的描述来看，第一次用载体上引物进行菌落PCR验证，出现阳性克隆，但测序不对；第二次用载体和片段的引物，未出现阳性克隆。
一般来讲，质粒转BL21成功率很高，你得到了较多的转化子，转化应该是没有问题的。
可以绕过菌落PCR验证，选择4~10个转化子进行酶切验证，因为菌落PCR假阳性较高
一定要菌落PCR的话用你的第二次方法，多挑点转化子，一次做30个，嘿嘿

还有从你的描述上看你才做了一次转化，也可以再重复一次看看
再给你个经验，尽量挑取菌落小的克隆子，分散着挑别扎堆

这个都是模式化的操作，没问题的，再试试呗
赞一下 回复此楼
5楼2015-10-12 17:24:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 311求调剂 +3 冬十三 2026-03-18 3/150 2026-03-18 17:15 by 216的故事
[考研] 0854可跨调剂，一作一项核心论文五项专利，省、国级证书40+数一英一287 +8 小李0854 2026-03-16 8/400 2026-03-18 14:35 by 搏击518
[考研] 297求调剂 +8 戏精丹丹丹 2026-03-17 8/400 2026-03-18 14:30 by laoshidan
[考研] 070300化学319求调剂 +6 锦鲤0909 2026-03-17 6/300 2026-03-18 13:22 by Iveryant
[考研] 307求调剂 +3 冷笙123 2026-03-17 3/150 2026-03-18 09:55 by macy2011
[考研] 301求调剂 +9 yy要上岸呀 2026-03-17 9/450 2026-03-18 08:58 by 无际的草原
[考研] 302求调剂 +9 负心者当诛 2026-03-11 9/450 2026-03-17 17:13 by ruiyingmiao
[考博] 26申博 +4 八旬速览 2026-03-16 4/200 2026-03-17 13:00 by 轻松不少随
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自动化所实习 +6 Losir 2026-03-12 7/350 2026-03-17 12:09 by danranxie
[考研] [导师推荐]西南科技大学国防/材料导师推荐 +3 尖角小荷 2026-03-16 6/300 2026-03-16 23:21 by 尖角小荷
[考研] 070300化学学硕求调剂 +6 太想进步了0608 2026-03-16 6/300 2026-03-16 16:13 by kykm678
[考研] 机械专硕调剂 +3 笨笨兔子 2026-03-12 3/150 2026-03-15 20:02 by 栗子粥?
[考研] 26考研一志愿中国石油大学(华东)305分求调剂 +3 嘉年新程 2026-03-15 3/150 2026-03-15 13:58 by 哈哈哈哈嘿嘿嘿
[考研] 070305求调剂 +3 mlpqaz03 2026-03-14 4/200 2026-03-15 11:04 by peike
[考研] 材料与化工 323 英一+数二+物化，一志愿：哈工大 本人本科双一流 +4 自由的_飞翔 2026-03-13 5/250 2026-03-14 19:39 by hmn_wj
[考研] 一志愿哈工大材料324分求调剂 +5 闫旭东 2026-03-14 5/250 2026-03-14 14:53 by 木瓜膏
[考研] 304求调剂 +7 7712b 2026-03-13 7/350 2026-03-13 21:42 by peike
[考研] 281求调剂 +9 Koxui 2026-03-12 11/550 2026-03-13 20:50 by Koxui
[考研] 274求调剂 +3 S.H1 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:15 by JourneyLucky
[考研] 321求调剂（食品/专硕） +3 xc321 2026-03-12 6/300 2026-03-13 08:45 by xc321
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭