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LeonardoChen

金虫 (小有名气)

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专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 重组质粒转化后提的平板有很多菌落，但是菌落PCR 没有结果。已有3人参与

重组质粒PET28a，转化到大肠杆菌（BL21），涂布到平板，37℃，培养14h左右，单菌落数有很多然后随机挑取10单菌落，加入50微升无菌水，煮沸40min，做菌落PCR，第一次pcr体系是：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7引物，1微升T7Terminator ，86微升无菌水。分装每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，进行PCR，跑胶结果显示有阳性克隆，但是测序结果显示都是假阳性。
第二次尝试用另一种方法：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7Terminator ，1微升引物R（就是自己刚开始做克隆设计的引物），86微升无菌水。分装每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，进行PCR，跑胶结果显示都没有阳性克隆。
PCR反应条件：95℃ 5min，Sample Text 72℃ 10min，4.0℃ pause

各位能不能帮我分析下，为什么单菌落那么多却没有阳性克隆，如果是实验操作的原因最可能会出现在哪一步？谢谢，不甚感激！

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