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andywang6137木虫 (著名写手)
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最近TA克隆老是失败，请大家分析一下。已有9人参与
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PCR产物，胶回收后TA克隆，板子总长成这样，请高手分析一下原因。taq酶，宝生物的；胶回收试剂盒，全式金的；T载体，用过生工和全式金的。感受态细胞，全式金和自己制备的。之前还做出来了，上学的时候TA克隆也没出过问题，现在涂的板子老是长成下面图片这样。我自己动手做了一次，2个研究生做了一次都是下面的结果（图1：准备回收的目的片段；图2-4，平板菌液，学生发过来的，忘记那一个是水做的对照）。分析不出来原因，请高手分析一下。谢谢！ 0.jpg  1.jpg  2.jpg  3.jpg |
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【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-09-27 23:03:59
andywang6137: 金币+30, 感谢详细解答 2015-10-08 10:42:31
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andywang6137: 金币+30, 感谢详细解答 2015-10-08 10:42:31
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看平板，似乎不是楼上几位说的简单的浓度太高，本人分析原因可能有以下介个： 1. 如果目的片段很短（小于500 bp），复苏时间较长（超过1小时），涂板前进行了集菌，会出现上述情况，如楼上几位所说，改进方法就是缩短复苏时间或者取消该步，然后减少涂板菌量； 2. 感受态问题，我曾出现过，制备感受态的菌污染，导致制备的感受态是含有质粒的，这样的话即使是用水做转化也会出现上述情况，建议排查； 3. 检查一下抗生素是否失效，这种情况我也遇到过，无论怎么转化均出现上述情况，后来发现抗生素失效，用了新的抗生素，立马正常了，如果使用的抗生素与质粒上的抗性基因不一致也会出现上述情况，建议排查； 4. 如果上述情况均不是主要原因，可以考虑蓝白斑筛选加阴阳性对照，找到产生上述情况的原因 祝好 |
5楼2015-09-26 10:08:53
andywang6137
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首先谢谢你详细的回答。关于你分析的几个原因，我做一下说明，你看还有没有什么建议： 1、目的片段大约750bp，我用的是2K的marher。转化之后复苏时间1个小时左右，有的时候时间比较长（不超过2小时），没有集菌。涂板用量50ul。个人感觉摇菌时间这一块应该可以优化，缩短一下时间看看效果。 2、感受态，买的感受态和自己制备的感受态现在都出现这种状况。之前我自己做的，做出实验结果的感受态细胞也是目前这种情况。感受态这一块拿不准，买的感受态，自己制作的和学生做的，都出现这样的状况。 3、Amp的问题。这个之前没考虑到，一直以为可能是载体和感受态的问题，两个都换过还是没有解决问题。Amp准备重新定一只新的。涂板只用了Amp，IPTG和x-gal没有用。 4、阴阳性对照，学生报道说也是上述情况。上述图片其中一个是加水的对照。 5、请问板子中一团糊的也是因为浓度太高的缘故，还是其他原因？涂板用量已经缩小到50ul。涂板不均匀这个试验中很常见，挑到目的基因克隆子即可。一团糊的我一直难以理解，重新做新的培养基也是这个情况。要说浓度高，上学的时候经常做，浓度也有非常高的，可没有出现过一团糊的情况。 读书时做TA克隆基本没有失败过，目前出现这种情况换了一些试剂盒条件，始终没有找到有效的解决办法。 |
7楼2015-09-27 20:29:13
chenli1017
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2楼2015-09-25 18:33:37
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3楼2015-09-25 20:00:12
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andywang6137
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8楼2015-09-27 20:36:54
andywang6137
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9楼2015-09-27 20:57:23
【答案】应助回帖
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按你说的情况，加水也出现上述情况，那么就只有两种原因了，就是我说的第二三两种，按你所说感受态出问题的可能性不大，那么就是抗生素的问题了，你可以挑取五到十个菌斑，用M13通用引物进行PCR验证，如果绝大部分有产物，说明抗生素没问题，如果大部分无产物，抗生素失效，不过前提是感受态没问题，最好换换抗生素吧 发自小木虫Android客户端 |
10楼2015-09-27 22:28:06