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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 最近TA克隆老是失败，请大家分析一下。
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andywang6137

木虫 (著名写手)

[求助] 最近TA克隆老是失败，请大家分析一下。 已有9人参与

PCR产物，胶回收后TA克隆，板子总长成这样，请高手分析一下原因。taq酶，宝生物的；胶回收试剂盒，全式金的；T载体，用过生工和全式金的。感受态细胞，全式金和自己制备的。之前还做出来了，上学的时候TA克隆也没出过问题，现在涂的板子老是长成下面图片这样。我自己动手做了一次，2个研究生做了一次都是下面的结果（图1：准备回收的目的片段；图2-4，平板菌液，学生发过来的，忘记那一个是水做的对照）。分析不出来原因，请高手分析一下。谢谢！

最近TA克隆老是失败，请大家分析一下。
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最近TA克隆老是失败，请大家分析一下。-1
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最近TA克隆老是失败，请大家分析一下。-2
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最近TA克隆老是失败，请大家分析一下。-3
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1楼 2015-09-25 18:00:34
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by andywang6137 at 2015-09-27 20:29:13
首先谢谢你详细的回答。关于你分析的几个原因，我做一下说明，你看还有没有什么建议：
1、目的片段大约750bp，我用的是2K的marher。转化之后复苏时间1个小时左右，有的时候时间比较长（不超过2小时），没有集菌。 ...

按你说的情况，加水也出现上述情况，那么就只有两种原因了，就是我说的第二三两种，按你所说感受态出问题的可能性不大，那么就是抗生素的问题了，你可以挑取五到十个菌斑，用M13通用引物进行PCR验证，如果绝大部分有产物，说明抗生素没问题，如果大部分无产物，抗生素失效，不过前提是感受态没问题，最好换换抗生素吧

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没有做不到，只有想不到！
10楼2015-09-27 22:28:06
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chenli1017

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
浓度太高，稀释下，涂皿不均匀

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2楼2015-09-25 18:33:37
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songjie851

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼上正解，涂板时候少加点菌液，涂均匀点

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3楼2015-09-25 20:00:12
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cosmoslight

金虫 (小有名气)
转化完直接涂板，应该没这么多

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4楼2015-09-25 20:08:16
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