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andywang6137木虫 (著名写手)
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[求助]
最近TA克隆老是失败，请大家分析一下。 已有9人参与
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PCR产物，胶回收后TA克隆，板子总长成这样，请高手分析一下原因。taq酶，宝生物的；胶回收试剂盒，全式金的；T载体，用过生工和全式金的。感受态细胞，全式金和自己制备的。之前还做出来了，上学的时候TA克隆也没出过问题，现在涂的板子老是长成下面图片这样。我自己动手做了一次，2个研究生做了一次都是下面的结果（图1：准备回收的目的片段；图2-4，平板菌液，学生发过来的，忘记那一个是水做的对照）。分析不出来原因，请高手分析一下。谢谢！ 0.jpg  1.jpg  2.jpg  3.jpg |
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4楼2015-09-25 20:08:16
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2楼2015-09-25 18:33:37
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3楼2015-09-25 20:00:12
【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-09-27 23:03:59
andywang6137: 金币+30, 感谢详细解答 2015-10-08 10:42:31
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andywang6137: 金币+30, 感谢详细解答 2015-10-08 10:42:31
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看平板，似乎不是楼上几位说的简单的浓度太高，本人分析原因可能有以下介个： 1. 如果目的片段很短（小于500 bp），复苏时间较长（超过1小时），涂板前进行了集菌，会出现上述情况，如楼上几位所说，改进方法就是缩短复苏时间或者取消该步，然后减少涂板菌量； 2. 感受态问题，我曾出现过，制备感受态的菌污染，导致制备的感受态是含有质粒的，这样的话即使是用水做转化也会出现上述情况，建议排查； 3. 检查一下抗生素是否失效，这种情况我也遇到过，无论怎么转化均出现上述情况，后来发现抗生素失效，用了新的抗生素，立马正常了，如果使用的抗生素与质粒上的抗性基因不一致也会出现上述情况，建议排查； 4. 如果上述情况均不是主要原因，可以考虑蓝白斑筛选加阴阳性对照，找到产生上述情况的原因 祝好 |
5楼2015-09-26 10:08:53
