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andywang6137木虫 (著名写手)
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最近TA克隆老是失败，请大家分析一下。已有9人参与
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PCR产物，胶回收后TA克隆，板子总长成这样，请高手分析一下原因。taq酶，宝生物的；胶回收试剂盒，全式金的；T载体，用过生工和全式金的。感受态细胞，全式金和自己制备的。之前还做出来了，上学的时候TA克隆也没出过问题，现在涂的板子老是长成下面图片这样。我自己动手做了一次，2个研究生做了一次都是下面的结果（图1：准备回收的目的片段；图2-4，平板菌液，学生发过来的，忘记那一个是水做的对照）。分析不出来原因，请高手分析一下。谢谢！ 0.jpg  1.jpg  2.jpg  3.jpg |
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andywang6137
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首先谢谢你详细的回答。关于你分析的几个原因，我做一下说明，你看还有没有什么建议： 1、目的片段大约750bp，我用的是2K的marher。转化之后复苏时间1个小时左右，有的时候时间比较长（不超过2小时），没有集菌。涂板用量50ul。个人感觉摇菌时间这一块应该可以优化，缩短一下时间看看效果。 2、感受态，买的感受态和自己制备的感受态现在都出现这种状况。之前我自己做的，做出实验结果的感受态细胞也是目前这种情况。感受态这一块拿不准，买的感受态，自己制作的和学生做的，都出现这样的状况。 3、Amp的问题。这个之前没考虑到，一直以为可能是载体和感受态的问题，两个都换过还是没有解决问题。Amp准备重新定一只新的。涂板只用了Amp，IPTG和x-gal没有用。 4、阴阳性对照，学生报道说也是上述情况。上述图片其中一个是加水的对照。 5、请问板子中一团糊的也是因为浓度太高的缘故，还是其他原因？涂板用量已经缩小到50ul。涂板不均匀这个试验中很常见，挑到目的基因克隆子即可。一团糊的我一直难以理解，重新做新的培养基也是这个情况。要说浓度高，上学的时候经常做，浓度也有非常高的，可没有出现过一团糊的情况。 读书时做TA克隆基本没有失败过，目前出现这种情况换了一些试剂盒条件，始终没有找到有效的解决办法。 |
7楼2015-09-27 20:29:13
chenli1017
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2楼2015-09-25 18:33:37
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3楼2015-09-25 20:00:12
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4楼2015-09-25 20:08:16