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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by andywang6137 at 2015-09-27 20:29:13
首先谢谢你详细的回答。关于你分析的几个原因,我做一下说明,你看还有没有什么建议:
1、目的片段大约750bp,我用的是2K的marher。转化之后复苏时间1个小时左右,有的时候时间比较长(不超过2小时),没有集菌。 ...

做TA克隆一团糊,基本就是平板菌量太高所致,有两个方面,一方面是转化效率太高,主要是目的片段太短,复苏时间过长,过分集菌以及培养时间过长等原因所致,第二方面就是抗生素起不到作用,这又有两个方面,一是抗生素失效,无法杀死空菌,二是抗生素假失效,即感受态本身含有T质粒,无论该质粒连接的是什么片段,抗生素均不能将其杀死,导致糊成一片,从而表现出抗生素失效。

从你给出的数据,出问题的可能是第二方面的第一点,换个抗生素试试吧

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没有做不到,只有想不到!
11楼2015-09-27 22:40:58
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仁者努力

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
andywang6137: 金币+10, 有帮助, 感谢帮助 2015-10-08 10:43:28
你的应该是两个原因一是抗性失效了另外是活化的时间太长了,   五十分钟就够了,     时间太长也会出现这种情况,你摇一到两个小时时间太长了,还有你最好做个蓝白斑筛选

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加油
12楼2015-09-27 22:50:46
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夏雨天的你

新虫 (正式写手)


不是感受态污染就是转化效率太高,如果自己制的感受态前者的可能性大

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13楼2015-09-27 23:11:32
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想学好的学渣

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
andywang6137: 金币+10, 感谢帮助 2015-10-08 10:43:43
个人感觉,一是有可能涂平板菌液浓度过高,二是有可能抗生素失效,三是有可能连接的时候用的目的片段量过高,PCR回收时亮度比maker还亮,就需要减少目的片段样本量…我平常出的问题就这三个…不晓得能不能帮助到你

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14楼2015-09-27 23:23:05
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smalljie

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
复苏摇菌一个小时足以!

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梦想就是让你感到坚持就是一种幸福的东西!
15楼2015-09-28 00:12:13
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glssg

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
lb培养基,检查是否污染,换一瓶新的,摇一下没有浑浊的。

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不安于现在而又安于现在
16楼2015-09-28 08:00:04
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moqiyilei

金虫 (小有名气)

你的水对照也长菌,那指定是抗生素失效,换新的抗生素。
17楼2015-09-28 15:06:47
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yet

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

三个板子,包括水对照都长菌液
根据我的经验,是学生涂板没有涂好。(如果排除抗生素失效的原因,不过我说的可能性更大)
要用涂布棒一直不停的涂,直到涂干,涂干,涂干为止。
18楼2015-09-28 20:18:09
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andywang6137

木虫 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 王平阳 at 2015-09-26 10:08:53
看平板,似乎不是楼上几位说的简单的浓度太高,本人分析原因可能有以下介个:
1. 如果目的片段很短(小于500 bp),复苏时间较长(超过1小时),涂板前进行了集菌,会出现上述情况,如楼上几位所说,改进方法就是缩 ...

你好,这是我重新做实验的结果,重新PCR扩增,胶回收,TA克隆,LB培养基(全部新买的试剂),Amp(用的还是之前买的生工的,新买的氨苄粉末由于超纯水仪器坏了,怕水质太差,没有配)。摇菌复苏1小时,涂板菌液取了50ul,没有富集。这是板子生长的结果(目的基因的,没做对照),挑去白斑检测结果全是空载体。一团一团糊一样的东西,我在网上也查找了一下,有点人说是感受态的死细胞。不知道是否正确?这种结果,是否需要将所有的试剂全换一遍?
最近TA克隆老是失败,请大家分析一下。
IMG_20151010_104659.jpg

19楼2015-10-11 22:27:19
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yspain

新虫 (小有名气)

我们实验室也出现过这样的现象,最后验证是感受态出了问题

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20楼2015-10-11 23:48:52
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