应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » T克隆，质粒连接，抓狂了！
161/2返回列表12下一页
查看: 1546  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

99蜗牛99

新虫 (小有名气)

[交流] T克隆，质粒连接，抓狂了！ 已有2人参与

首先PCR获得了目的基因，之后尝试将目的基因与载体双酶切，然后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，连接了很多次了，有的时候板上长菌很少，有的时候长菌很多，但菌落PCR验证的时候都没有目的条带。。。
   然后试着把目的基因先连接到T载体上，可是刚刚PCR验证时，菌落PCR也没有目的条带，有些迷茫了，求前辈们指点。。。谢谢。。。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2015-09-14 23:24:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

兰兰园丁

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
99蜗牛99: 金币+1 2015-09-15 21:34:08
我也老遇到这种问题，但是，如果不是因为操作的错误的话，问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同，发现做出来的可能也不同。

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2015-09-15 00:10:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

biostar2009

专家顾问 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 99蜗牛99 at 2015-09-15 10:18:55
两个酶切位点是不一样的，载体也可能自连接吗...

什么事情会是100%的呢？不谈效率，都是瞎扯
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2015-09-15 10:38:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

viki_MDK

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
99蜗牛99: 金币+2 2015-09-15 21:34:44
载体多切一会，产物也多切一会，确保回收的载体片段没有原质粒，还有就是挑去的克隆扩征后可以先提取质粒，用酶切鉴定
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2015-09-15 10:49:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
99蜗牛99: 金币+2 2015-09-15 21:35:01
可以详细的叙述实验步骤么？
比如用神马酶P的多少大小的gene，引物两端有酶切位点，外面有几个保护碱基或者同源臂，然后如何操作的酶切和连接？等等。。。你说的太简单没法给你找问题。
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2015-09-15 12:01:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 兰兰园丁 at 2015-09-15 00:10:33
我也老遇到这种问题，但是，如果不是因为操作的错误的话，问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同，发现做出来的可能也不同。

谢谢你。。。。
回复此楼
3楼2015-09-15 09:17:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 兰兰园丁 at 2015-09-15 00:10:33
我也老遇到这种问题，但是，如果不是因为操作的错误的话，问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同，发现做出来的可能也不同。

没有经过T克隆这一步，直接将目的基因与载体双酶切，连接，转化，涂板。PCR菌落鉴定不出目的条带。
    是因为双酶切目的条带与质粒没有切好，导致没有连接成功？两者哪个更不好切呢？但是加了氨苄的平板上有菌落，我想问一下，如果是没有酶切好的空载体可以转化进去吗？
赞一下 回复此楼
4楼2015-09-15 09:42:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小_菜鸟

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 99蜗牛99 at 2015-09-15 09:42:54
没有经过T克隆这一步，直接将目的基因与载体双酶切，连接，转化，涂板。PCR菌落鉴定不出目的条带。
    是因为双酶切目的条带与质粒没有切好，导致没有连接成功？两者哪个更不好切呢？但是加了氨苄的平板上有菌落 ...

有可能是回收到了没有切完全的载体，也可能是载体自连了。
赞一下 回复此楼
5楼2015-09-15 10:15:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小_菜鸟 at 2015-09-15 10:15:04
有可能是回收到了没有切完全的载体，也可能是载体自连了。...

两个酶切位点是不一样的，载体也可能自连接吗
赞一下 回复此楼
6楼2015-09-15 10:18:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by viki_MDK at 2015-09-15 10:49:13
载体多切一会，产物也多切一会，确保回收的载体片段没有原质粒，还有就是挑去的克隆扩征后可以先提取质粒，用酶切鉴定

谢谢你，接下来我打算试一下。。。
赞一下 回复此楼
9楼2015-09-15 10:57:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 99蜗牛99 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 297求调剂 +5 田洪有 2026-03-26 5/250 2026-03-26 15:43 by 无际的草原
[考研] 263求调剂 +6 yqdszhdap－ 2026-03-22 10/500 2026-03-26 13:11 by 公瑾逍遥
[材料工程] 一志愿C9材料与化工专业总分300求调剂 +5 曼111 2026-03-24 6/300 2026-03-26 13:04 by 13756423260
[考研] 296求调剂 +5 www_q 2026-03-20 5/250 2026-03-26 12:56 by 3Strings
[考研] 299求调剂 +4 15188958825 2026-03-25 4/200 2026-03-25 22:56 by 418490947
[考研] 考研调剂 +6 来好运来来来 2026-03-21 7/350 2026-03-25 22:43 by 418490947
[考研] 一志愿南航 335分 | 0856材料化工 | GPA 4.07 | 有科研经历 +6 cccchenso 2026-03-23 6/300 2026-03-25 22:25 by 544594351
[考研] 334分 一志愿武理-080500 材料求调剂 +4 李李不服输 2026-03-25 4/200 2026-03-25 21:26 by 星空星月
[考研] 一志愿中南大学化学学硕0703总分337求调剂 +7 niko- 2026-03-22 7/350 2026-03-25 20:14 by qingfeng258
[考研] 311求调剂 +4 勇敢的小吴 2026-03-20 4/200 2026-03-25 18:12 by xcjcqu
[考研] 0854电子信息求调剂 324 +4 Promise-jyl 2026-03-23 4/200 2026-03-25 11:36 by Sugarlight
[考研] 318求调剂 +3 plum李子 2026-03-23 3/150 2026-03-25 09:42 by 雾散后相遇lc
[考研] 化学调剂 +6 yzysaa 2026-03-21 6/300 2026-03-25 09:27 by aa331100
[考研] 070300化学求调剂 +9 苑豆豆 2026-03-20 9/450 2026-03-24 17:15 by licg0208
[考研] 384求调剂 +3 子系博 2026-03-22 6/300 2026-03-23 21:45 by 子系博
[考研] 276求调剂 +3 YNRYG 2026-03-21 4/200 2026-03-23 08:31 by 醉在风里
[考研] 315分，诚求调剂，材料与化工085600 +3 13756423260 2026-03-22 3/150 2026-03-22 20:11 by edmund7
[考研] 319求调剂 +4 小力气珂珂 2026-03-20 4/200 2026-03-22 15:53 by ColorlessPI
[考研] 求调剂院校信息 +6 CX 330 2026-03-21 6/300 2026-03-22 15:25 by 无懈可击111
[考研] 一志愿 南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕 +5 @taotao 2026-03-20 5/250 2026-03-20 20:16 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭