应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » T克隆，质粒连接，抓狂了！
51/1返回列表
查看: 1544  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

99蜗牛99

新虫 (小有名气)

[交流] T克隆，质粒连接，抓狂了！ 已有2人参与

首先PCR获得了目的基因，之后尝试将目的基因与载体双酶切，然后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，连接了很多次了，有的时候板上长菌很少，有的时候长菌很多，但菌落PCR验证的时候都没有目的条带。。。
   然后试着把目的基因先连接到T载体上，可是刚刚PCR验证时，菌落PCR也没有目的条带，有些迷茫了，求前辈们指点。。。谢谢。。。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2015-09-14 23:24:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小_菜鸟

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 99蜗牛99 at 2015-09-15 09:42:54
没有经过T克隆这一步，直接将目的基因与载体双酶切，连接，转化，涂板。PCR菌落鉴定不出目的条带。
    是因为双酶切目的条带与质粒没有切好，导致没有连接成功？两者哪个更不好切呢？但是加了氨苄的平板上有菌落 ...

有可能是回收到了没有切完全的载体，也可能是载体自连了。
赞一下 回复此楼
5楼2015-09-15 10:15:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答

兰兰园丁

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
99蜗牛99: 金币+1 2015-09-15 21:34:08
我也老遇到这种问题，但是，如果不是因为操作的错误的话，问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同，发现做出来的可能也不同。

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2015-09-15 00:10:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 兰兰园丁 at 2015-09-15 00:10:33
我也老遇到这种问题，但是，如果不是因为操作的错误的话，问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同，发现做出来的可能也不同。

谢谢你。。。。
回复此楼
3楼2015-09-15 09:17:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 兰兰园丁 at 2015-09-15 00:10:33
我也老遇到这种问题，但是，如果不是因为操作的错误的话，问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同，发现做出来的可能也不同。

没有经过T克隆这一步，直接将目的基因与载体双酶切，连接，转化，涂板。PCR菌落鉴定不出目的条带。
    是因为双酶切目的条带与质粒没有切好，导致没有连接成功？两者哪个更不好切呢？但是加了氨苄的平板上有菌落，我想问一下，如果是没有酶切好的空载体可以转化进去吗？
赞一下 回复此楼
4楼2015-09-15 09:42:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0856求调剂 +6 zhn03 2026-03-25 7/350 2026-03-26 08:51 by zhyzzh
[考研] 303求调剂 +6 蓝山月 2026-03-25 6/300 2026-03-25 22:47 by 418490947
[考研] 材料专硕 335 分求调剂 +4 拒绝冷暴力 2026-03-25 4/200 2026-03-25 18:45 by haxia
[考研] 材料与化工 322求调剂 +6 然11 2026-03-19 6/300 2026-03-25 18:37 by haxia
[考研] 材料学硕，求调剂 6+4 糖葫芦888ll 2026-03-22 9/450 2026-03-25 11:19 by greychen00
[考研] 080500求调剂 +3 zzzzfan 2026-03-24 3/150 2026-03-24 16:38 by barlinike
[考研] 300求调剂，材料科学英一数二 +5 leaflight 2026-03-24 5/250 2026-03-24 16:25 by laoshidan
[考研] 321求调剂 +4 Ymlll 2026-03-24 4/200 2026-03-24 14:44 by sprinining
[考研] 335求调剂 +4 yuyu宇 2026-03-23 5/250 2026-03-23 23:49 by Txy@872106
[考研] 材料/农业专业，07/08开头均可，过线就行 +3 呵唔哦豁 2026-03-23 4/200 2026-03-23 22:30 by 汪！？！
[考研] 一志愿070300浙大化学358分，求调剂！ +4 酥酥鱼.. 2026-03-21 4/200 2026-03-23 08:12 by Iveryant
[考研] 一志愿东华大学化学070300，求调剂 +7 2117205181 2026-03-21 8/400 2026-03-22 22:55 by chixmc
[考研] 311求调剂 +3 26研0 2026-03-20 3/150 2026-03-22 14:46 by ColorlessPI
[考研] 269专硕求调剂 +6 金恩贝 2026-03-21 6/300 2026-03-22 14:31 by ColorlessPI
[考研] 296求调剂 +4 www_q 2026-03-20 4/200 2026-03-21 17:26 by 学员8dgXkO
[考研] 336求调剂 +5 rmc8866 2026-03-21 5/250 2026-03-21 17:24 by 学员8dgXkO
[考研] 南昌大学材料专硕311分求调剂 +6 77chaselx 2026-03-20 6/300 2026-03-21 07:24 by JourneyLucky
[考研] 290求调剂 +7 ^O^乜 2026-03-19 7/350 2026-03-20 21:43 by JourneyLucky
[考研] 261求B区调剂，科研经历丰富 +3 牛奶很忙 2026-03-20 4/200 2026-03-20 19:34 by JourneyLucky
[考研] 一志愿南理工085701环境302求调剂院校 +3 葵梓卫队 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:28 by zhukairuo
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭