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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » T克隆，质粒连接，抓狂了！
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)

[交流] T克隆，质粒连接，抓狂了！ 已有2人参与

首先PCR获得了目的基因，之后尝试将目的基因与载体双酶切，然后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，连接了很多次了，有的时候板上长菌很少，有的时候长菌很多，但菌落PCR验证的时候都没有目的条带。。。
   然后试着把目的基因先连接到T载体上，可是刚刚PCR验证时，菌落PCR也没有目的条带，有些迷茫了，求前辈们指点。。。谢谢。。。
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1楼 2015-09-14 23:24:54
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兰兰园丁

木虫 (著名写手)
★ ★
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99蜗牛99: 金币+1 2015-09-15 21:34:08
我也老遇到这种问题，但是，如果不是因为操作的错误的话，问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同，发现做出来的可能也不同。

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2楼2015-09-15 00:10:33
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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6楼: Originally posted by 99蜗牛99 at 2015-09-15 10:18:55
两个酶切位点是不一样的，载体也可能自连接吗...

什么事情会是100%的呢？不谈效率，都是瞎扯
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7楼2015-09-15 10:38:35
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
99蜗牛99: 金币+2 2015-09-15 21:34:44
载体多切一会，产物也多切一会，确保回收的载体片段没有原质粒，还有就是挑去的克隆扩征后可以先提取质粒，用酶切鉴定
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8楼2015-09-15 10:49:13
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
99蜗牛99: 金币+2 2015-09-15 21:35:01
可以详细的叙述实验步骤么？
比如用神马酶P的多少大小的gene，引物两端有酶切位点，外面有几个保护碱基或者同源臂，然后如何操作的酶切和连接？等等。。。你说的太简单没法给你找问题。
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10楼2015-09-15 12:01:50
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普通回帖

99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 兰兰园丁 at 2015-09-15 00:10:33
我也老遇到这种问题，但是，如果不是因为操作的错误的话，问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同，发现做出来的可能也不同。

谢谢你。。。。
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3楼2015-09-15 09:17:28
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 兰兰园丁 at 2015-09-15 00:10:33
我也老遇到这种问题，但是，如果不是因为操作的错误的话，问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同，发现做出来的可能也不同。

没有经过T克隆这一步，直接将目的基因与载体双酶切，连接，转化，涂板。PCR菌落鉴定不出目的条带。
    是因为双酶切目的条带与质粒没有切好，导致没有连接成功？两者哪个更不好切呢？但是加了氨苄的平板上有菌落，我想问一下，如果是没有酶切好的空载体可以转化进去吗？
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4楼2015-09-15 09:42:54
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小_菜鸟

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 99蜗牛99 at 2015-09-15 09:42:54
没有经过T克隆这一步，直接将目的基因与载体双酶切，连接，转化，涂板。PCR菌落鉴定不出目的条带。
    是因为双酶切目的条带与质粒没有切好，导致没有连接成功？两者哪个更不好切呢？但是加了氨苄的平板上有菌落 ...

有可能是回收到了没有切完全的载体，也可能是载体自连了。
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5楼2015-09-15 10:15:04
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小_菜鸟 at 2015-09-15 10:15:04
有可能是回收到了没有切完全的载体，也可能是载体自连了。...

两个酶切位点是不一样的，载体也可能自连接吗
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6楼2015-09-15 10:18:55
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by viki_MDK at 2015-09-15 10:49:13
载体多切一会，产物也多切一会，确保回收的载体片段没有原质粒，还有就是挑去的克隆扩征后可以先提取质粒，用酶切鉴定

谢谢你，接下来我打算试一下。。。
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9楼2015-09-15 10:57:06
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