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99蜗牛99

新虫 (小有名气)

[交流] T克隆,质粒连接,抓狂了! 已有2人参与

首先PCR获得了目的基因,之后尝试将目的基因与载体双酶切,然后用T4DNA连接酶16℃过夜连接,连接了很多次了,有的时候板上长菌很少,有的时候长菌很多,但菌落PCR验证的时候都没有目的条带。。。
   然后试着把目的基因先连接到T载体上,可是刚刚PCR验证时,菌落PCR也没有目的条带,有些迷茫了,求前辈们指点。。。谢谢。。。
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
99蜗牛99: 金币+2 2015-09-15 21:35:01
可以详细的叙述实验步骤么?
比如用神马酶P的多少大小的gene,引物两端有酶切位点,外面有几个保护碱基或者同源臂,然后如何操作的酶切和连接?等等。。。你说的太简单没法给你找问题。
10楼2015-09-15 12:01:50
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兰兰园丁

木虫 (著名写手)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
99蜗牛99: 金币+1 2015-09-15 21:34:08
我也老遇到这种问题,但是,如果不是因为操作的错误的话,问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同,发现做出来的可能也不同。

发自小木虫Android客户端
2楼2015-09-15 00:10:33
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 兰兰园丁 at 2015-09-15 00:10:33
我也老遇到这种问题,但是,如果不是因为操作的错误的话,问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同,发现做出来的可能也不同。

谢谢你。。。。
3楼2015-09-15 09:17:28
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 兰兰园丁 at 2015-09-15 00:10:33
我也老遇到这种问题,但是,如果不是因为操作的错误的话,问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同,发现做出来的可能也不同。

没有经过T克隆这一步,直接将目的基因与载体双酶切,连接,转化,涂板。PCR菌落鉴定不出目的条带。
    是因为双酶切目的条带与质粒没有切好,导致没有连接成功?两者哪个更不好切呢?但是加了氨苄的平板上有菌落,我想问一下,如果是没有酶切好的空载体可以转化进去吗?
4楼2015-09-15 09:42:54
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