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99蜗牛99

新虫 (小有名气)

[交流] T克隆,质粒连接,抓狂了! 已有2人参与

首先PCR获得了目的基因,之后尝试将目的基因与载体双酶切,然后用T4DNA连接酶16℃过夜连接,连接了很多次了,有的时候板上长菌很少,有的时候长菌很多,但菌落PCR验证的时候都没有目的条带。。。
   然后试着把目的基因先连接到T载体上,可是刚刚PCR验证时,菌落PCR也没有目的条带,有些迷茫了,求前辈们指点。。。谢谢。。。
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

★ ★ ★
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99蜗牛99: 金币+2 2015-09-15 21:35:01
可以详细的叙述实验步骤么?
比如用神马酶P的多少大小的gene,引物两端有酶切位点,外面有几个保护碱基或者同源臂,然后如何操作的酶切和连接?等等。。。你说的太简单没法给你找问题。
10楼2015-09-15 12:01:50
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
11楼: Originally posted by 99蜗牛99 at 2015-09-15 13:48:50
PCR25uL体系:依次加入如下试剂
ddH2O:17.5 uL
Taq 酶Buffer :2.5uL                                            
dNTP:2 uL
模板:1 uL
引物  F:1uL
     R:1uL
Taq 酶:0.125 uL二、PCR反应条件:
...

你用的taq酶p1.2k的片段??保真性够么?够的话,倒是可以直接T-A克隆。。你PCR产物胶回收之后,测一下浓度,最好浓度在30ng/ul以上,这样,T载用1ul,片段用4ul,4度连接过夜,第二天转化。如果片段浓度只在10ng/ul以上,就0.5ul载体+4.5ul片段。低于10ng/ul你就可以考虑重新做胶回收了。。。
额外多说一句,如果这部搞定了,后期转化重组子(你的片段到你的目的载体)的时候同时转化一个只加了载体没加片段的negative ctrl以证实载体酶切完全。。另外,最好载体浓度也大于30ng/ul。。
12楼2015-09-15 13:58:44
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