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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » T克隆，质粒连接，抓狂了！
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)

[交流] T克隆，质粒连接，抓狂了！ 已有2人参与

首先PCR获得了目的基因，之后尝试将目的基因与载体双酶切，然后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，连接了很多次了，有的时候板上长菌很少，有的时候长菌很多，但菌落PCR验证的时候都没有目的条带。。。
   然后试着把目的基因先连接到T载体上，可是刚刚PCR验证时，菌落PCR也没有目的条带，有些迷茫了，求前辈们指点。。。谢谢。。。
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1楼 2015-09-14 23:24:54
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-09-15 12:01:50
可以详细的叙述实验步骤么？
比如用神马酶P的多少大小的gene，引物两端有酶切位点，外面有几个保护碱基或者同源臂，然后如何操作的酶切和连接？等等。。。你说的太简单没法给你找问题。

PCR25uL体系：依次加入如下试剂
ddH2O：17.5 uL
Taq 酶Buffer ：2.5uL                                            
dNTP：2 uL
模板：1 uL
引物  F：1uL
     R：1uL
Taq 酶：0.125 uL二、PCR反应条件：
预变性:95℃，5min
变性：94℃ ，30 s
退火：52℃，30 s          循环29次
延伸72℃，1min20s
三、琼脂糖凝胶电泳验证：
四、胶回收【去掉质粒载体】            
五、慢切酶酶切质粒，基因【2h】
六、琼脂糖凝胶电泳
七、胶回收双酶切产物
八、目的片段连接载体
九、转化感受态，涂布、培养
十、挑取阳性克隆，培养在LB中（加Amp+）菌落PCR，获得转化成功的菌
在第四步时，现在准备县构建T克隆，再酶切往下做。。。
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11楼2015-09-15 13:48:50
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兰兰园丁

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
99蜗牛99: 金币+1 2015-09-15 21:34:08
我也老遇到这种问题，但是，如果不是因为操作的错误的话，问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同，发现做出来的可能也不同。

发自小木虫Android客户端
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2楼2015-09-15 00:10:33
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 兰兰园丁 at 2015-09-15 00:10:33
我也老遇到这种问题，但是，如果不是因为操作的错误的话，问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同，发现做出来的可能也不同。

谢谢你。。。。
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3楼2015-09-15 09:17:28
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 兰兰园丁 at 2015-09-15 00:10:33
我也老遇到这种问题，但是，如果不是因为操作的错误的话，问题应该还是出在连接或者载体上。因为有的时候载体不同，发现做出来的可能也不同。

没有经过T克隆这一步，直接将目的基因与载体双酶切，连接，转化，涂板。PCR菌落鉴定不出目的条带。
    是因为双酶切目的条带与质粒没有切好，导致没有连接成功？两者哪个更不好切呢？但是加了氨苄的平板上有菌落，我想问一下，如果是没有酶切好的空载体可以转化进去吗？
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4楼2015-09-15 09:42:54
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