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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » T克隆，质粒连接，抓狂了！
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)
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10楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-09-15 12:01:50
可以详细的叙述实验步骤么？
比如用神马酶P的多少大小的gene，引物两端有酶切位点，外面有几个保护碱基或者同源臂，然后如何操作的酶切和连接？等等。。。你说的太简单没法给你找问题。

PCR25uL体系：依次加入如下试剂
ddH2O：17.5 uL
Taq 酶Buffer ：2.5uL                                            
dNTP：2 uL
模板：1 uL
引物  F：1uL
     R：1uL
Taq 酶：0.125 uL二、PCR反应条件：
预变性:95℃，5min
变性：94℃ ，30 s
退火：52℃，30 s          循环29次
延伸72℃，1min20s
三、琼脂糖凝胶电泳验证：
四、胶回收【去掉质粒载体】            
五、慢切酶酶切质粒，基因【2h】
六、琼脂糖凝胶电泳
七、胶回收双酶切产物
八、目的片段连接载体
九、转化感受态，涂布、培养
十、挑取阳性克隆，培养在LB中（加Amp+）菌落PCR，获得转化成功的菌
在第四步时，现在准备县构建T克隆，再酶切往下做。。。
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11楼2015-09-15 13:48:50
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
11楼: Originally posted by 99蜗牛99 at 2015-09-15 13:48:50
PCR25uL体系：依次加入如下试剂
ddH2O：17.5 uL
Taq 酶Buffer ：2.5uL                                            
dNTP：2 uL
模板：1 uL
引物  F：1uL
     R：1uL
Taq 酶：0.125 uL二、PCR反应条件：
...

你用的taq酶p1.2k的片段？？保真性够么？够的话，倒是可以直接T-A克隆。。你PCR产物胶回收之后，测一下浓度，最好浓度在30ng/ul以上，这样，T载用1ul，片段用4ul，4度连接过夜，第二天转化。如果片段浓度只在10ng/ul以上，就0.5ul载体+4.5ul片段。低于10ng/ul你就可以考虑重新做胶回收了。。。
额外多说一句，如果这部搞定了，后期转化重组子（你的片段到你的目的载体）的时候同时转化一个只加了载体没加片段的negative ctrl以证实载体酶切完全。。另外，最好载体浓度也大于30ng/ul。。
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12楼2015-09-15 13:58:44
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cwdy

铁虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by 99蜗牛99 at 2015-09-15 09:42:54
没有经过T克隆这一步，直接将目的基因与载体双酶切，连接，转化，涂板。PCR菌落鉴定不出目的条带。
    是因为双酶切目的条带与质粒没有切好，导致没有连接成功？两者哪个更不好切呢？但是加了氨苄的平板上有菌落 ...

PCR产物酶切的时间需要长一些，我都是选择酶切过夜的，酶切后做个纯化再连接。转化的时候可以做个阳性和阴性对照，看是不是转化这一步出了问题。你这样多步做下来的，要看是哪一步出了问题。。
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13楼2015-09-15 16:39:49
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肚糠稀同学

新虫 (初入文坛)
★
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考虑试一试把双酶切分两步来做  先用一个酶切  然后回收  再用另外一个酶切    我之前也是再怎么都连不上   这个方法可行
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14楼2015-09-16 20:40:43
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xygcdmr

木虫 (小有名气)
★
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你的片段是平末端的吧？T载体是连接粘性末端的，所以需要先给你的片段加A尾，再连接。
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15楼2015-09-16 21:23:01
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by xygcdmr at 2015-09-16 21:23:01
你的片段是平末端的吧？T载体是连接粘性末端的，所以需要先给你的片段加A尾，再连接。

我的是BamH1和Sal1记得是粘性末端呢
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16楼2015-09-17 09:37:54
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