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99蜗牛99

新虫 (小有名气)

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10楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-09-15 12:01:50
可以详细的叙述实验步骤么?
比如用神马酶P的多少大小的gene,引物两端有酶切位点,外面有几个保护碱基或者同源臂,然后如何操作的酶切和连接?等等。。。你说的太简单没法给你找问题。

PCR25uL体系:依次加入如下试剂
ddH2O:17.5 uL
Taq 酶Buffer :2.5uL                                            
dNTP:2 uL
模板:1 uL
引物  F:1uL
     R:1uL
Taq 酶:0.125 uL二、PCR反应条件:
预变性:95℃,5min
变性:94℃ ,30 s
退火:52℃,30 s          循环29次
延伸72℃,1min20s
三、琼脂糖凝胶电泳验证:
四、胶回收【去掉质粒载体】            
五、慢切酶酶切质粒,基因【2h】
六、琼脂糖凝胶电泳
七、胶回收双酶切产物
八、目的片段连接载体
九、转化感受态,涂布、培养
十、挑取阳性克隆,培养在LB中(加Amp+)菌落PCR,获得转化成功的菌
在第四步时,现在准备县构建T克隆,再酶切往下做。。。
11楼2015-09-15 13:48:50
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
11楼: Originally posted by 99蜗牛99 at 2015-09-15 13:48:50
PCR25uL体系:依次加入如下试剂
ddH2O:17.5 uL
Taq 酶Buffer :2.5uL                                            
dNTP:2 uL
模板:1 uL
引物  F:1uL
     R:1uL
Taq 酶:0.125 uL二、PCR反应条件:
...

你用的taq酶p1.2k的片段??保真性够么?够的话,倒是可以直接T-A克隆。。你PCR产物胶回收之后,测一下浓度,最好浓度在30ng/ul以上,这样,T载用1ul,片段用4ul,4度连接过夜,第二天转化。如果片段浓度只在10ng/ul以上,就0.5ul载体+4.5ul片段。低于10ng/ul你就可以考虑重新做胶回收了。。。
额外多说一句,如果这部搞定了,后期转化重组子(你的片段到你的目的载体)的时候同时转化一个只加了载体没加片段的negative ctrl以证实载体酶切完全。。另外,最好载体浓度也大于30ng/ul。。
12楼2015-09-15 13:58:44
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cwdy

铁虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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4楼: Originally posted by 99蜗牛99 at 2015-09-15 09:42:54
没有经过T克隆这一步,直接将目的基因与载体双酶切,连接,转化,涂板。PCR菌落鉴定不出目的条带。
    是因为双酶切目的条带与质粒没有切好,导致没有连接成功?两者哪个更不好切呢?但是加了氨苄的平板上有菌落 ...

PCR产物酶切的时间需要长一些,我都是选择酶切过夜的,酶切后做个纯化再连接。转化的时候可以做个阳性和阴性对照,看是不是转化这一步出了问题。你这样多步做下来的,要看是哪一步出了问题。。
13楼2015-09-15 16:39:49
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肚糠稀同学

新虫 (初入文坛)


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考虑试一试把双酶切分两步来做  先用一个酶切  然后回收  再用另外一个酶切    我之前也是再怎么都连不上   这个方法可行
14楼2015-09-16 20:40:43
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xygcdmr

木虫 (小有名气)


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你的片段是平末端的吧?T载体是连接粘性末端的,所以需要先给你的片段加A尾,再连接。
15楼2015-09-16 21:23:01
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by xygcdmr at 2015-09-16 21:23:01
你的片段是平末端的吧?T载体是连接粘性末端的,所以需要先给你的片段加A尾,再连接。

我的是BamH1和Sal1记得是粘性末端呢
16楼2015-09-17 09:37:54
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