应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » T克隆，质粒连接，抓狂了！
162/2返回列表上一页12
查看: 1778  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-09-15 12:01:50
可以详细的叙述实验步骤么？
比如用神马酶P的多少大小的gene，引物两端有酶切位点，外面有几个保护碱基或者同源臂，然后如何操作的酶切和连接？等等。。。你说的太简单没法给你找问题。

PCR25uL体系：依次加入如下试剂
ddH2O：17.5 uL
Taq 酶Buffer ：2.5uL                                            
dNTP：2 uL
模板：1 uL
引物  F：1uL
     R：1uL
Taq 酶：0.125 uL二、PCR反应条件：
预变性:95℃，5min
变性：94℃ ，30 s
退火：52℃，30 s          循环29次
延伸72℃，1min20s
三、琼脂糖凝胶电泳验证：
四、胶回收【去掉质粒载体】            
五、慢切酶酶切质粒，基因【2h】
六、琼脂糖凝胶电泳
七、胶回收双酶切产物
八、目的片段连接载体
九、转化感受态，涂布、培养
十、挑取阳性克隆，培养在LB中（加Amp+）菌落PCR，获得转化成功的菌
在第四步时，现在准备县构建T克隆，再酶切往下做。。。
赞一下 回复此楼
11楼2015-09-15 13:48:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
11楼: Originally posted by 99蜗牛99 at 2015-09-15 13:48:50
PCR25uL体系：依次加入如下试剂
ddH2O：17.5 uL
Taq 酶Buffer ：2.5uL                                            
dNTP：2 uL
模板：1 uL
引物  F：1uL
     R：1uL
Taq 酶：0.125 uL二、PCR反应条件：
...

你用的taq酶p1.2k的片段？？保真性够么？够的话，倒是可以直接T-A克隆。。你PCR产物胶回收之后，测一下浓度，最好浓度在30ng/ul以上，这样，T载用1ul，片段用4ul，4度连接过夜，第二天转化。如果片段浓度只在10ng/ul以上，就0.5ul载体+4.5ul片段。低于10ng/ul你就可以考虑重新做胶回收了。。。
额外多说一句，如果这部搞定了，后期转化重组子（你的片段到你的目的载体）的时候同时转化一个只加了载体没加片段的negative ctrl以证实载体酶切完全。。另外，最好载体浓度也大于30ng/ul。。
赞一下 回复此楼
12楼2015-09-15 13:58:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cwdy

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 99蜗牛99 at 2015-09-15 09:42:54
没有经过T克隆这一步，直接将目的基因与载体双酶切，连接，转化，涂板。PCR菌落鉴定不出目的条带。
    是因为双酶切目的条带与质粒没有切好，导致没有连接成功？两者哪个更不好切呢？但是加了氨苄的平板上有菌落 ...

PCR产物酶切的时间需要长一些，我都是选择酶切过夜的，酶切后做个纯化再连接。转化的时候可以做个阳性和阴性对照，看是不是转化这一步出了问题。你这样多步做下来的，要看是哪一步出了问题。。
赞一下 回复此楼
13楼2015-09-15 16:39:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

肚糠稀同学

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
考虑试一试把双酶切分两步来做  先用一个酶切  然后回收  再用另外一个酶切    我之前也是再怎么都连不上   这个方法可行
赞一下 回复此楼
14楼2015-09-16 20:40:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xygcdmr

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的片段是平末端的吧？T载体是连接粘性末端的，所以需要先给你的片段加A尾，再连接。
赞一下 回复此楼
15楼2015-09-16 21:23:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by xygcdmr at 2015-09-16 21:23:01
你的片段是平末端的吧？T载体是连接粘性末端的，所以需要先给你的片段加A尾，再连接。

我的是BamH1和Sal1记得是粘性末端呢
赞一下 回复此楼
16楼2015-09-17 09:37:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 99蜗牛99 的主题更新
162/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 好奇怪的filecode +3 布布和一二 2026-08-08 4/200 2026-08-08 17:46 by zhanghaozhu
[找工作] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 4/200 2026-08-08 17:07 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 4/200 2026-08-08 16:47 by oEVWOejN9taj
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 4/200 2026-08-08 16:27 by oEVWOejN9taj
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 4/200 2026-08-08 16:22 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 4/200 2026-08-08 16:19 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 十年后又回来了，论文投稿求助 +5 哈哈114477 2026-08-01 5/250 2026-08-08 15:14 by 仁砚薪传
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 6/300 2026-08-08 14:47 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 5/250 2026-08-08 14:22 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 5/250 2026-08-08 14:07 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +5 a089 2026-08-07 5/250 2026-08-08 14:04 by alian_214
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 6/300 2026-08-08 14:01 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 关于代码变化问题，想知道的进来 +11 且听虎啸 2026-08-07 14/700 2026-08-08 12:50 by 布布和一二
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 3/150 2026-08-08 03:47 by 6vVgjDL4CnGu
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +4 yang182083 2026-08-06 6/300 2026-08-07 12:43 by 虫友是什么虫
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭