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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 层析纯化出了问题
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小枯草

铜虫 (初入文坛)

[求助] 层析纯化出了问题 已有3人参与

用葡聚糖凝胶G100纯化蛋白，TRIS-HCl8.0的层析纯化图如下，哪位高人帮我指点一下

层析纯化出了问题
捕获.PNG
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闲暇时光
1楼 2015-07-08 21:05:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

a86052

金虫 (正式写手)
这样的峰图倒是遇见过，后来确认是蛋白的问题。后面那些峰是你的蛋白吗？
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2楼2015-07-09 09:15:37
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

我都要去下去吃饭了，现在正饿着那。不过我还是回答你吧。

你的层析峰有几个明显的问题：
1.分辨率低，2.对称性差，出现肩峰。

解决办法：
1.分辨率低。
(1)提高装柱的质量，使得色谱柱介质均匀。
(2)适当的提高柱床的高度。
(3)控制上样体积，上样量一般为柱床体积的1%-4%。
(4)减少样品的粘度，可以加入少量表面活性剂增溶。
(5)根据样品的特点，选用合适的习题哦溶液，调节洗脱溶液的离子强度和亲水性。
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6楼2015-07-16 14:12:04
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普通回帖

小枯草

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by a86052 at 2015-07-09 09:15:37
这样的峰图倒是遇见过，后来确认是蛋白的问题。后面那些峰是你的蛋白吗？

三个都是的，但是跑出来的效果太差了，想把图跑得好看点，峰分开些。
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闲暇时光
3楼2015-07-09 10:26:08
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永远的笑莲

铁虫 (初入文坛)
此图一看就是电脑的原因。电脑的性能和配置跟不上。直接换电脑或升级电脑。
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4楼2015-07-13 14:29:22
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小枯草

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 永远的笑莲 at 2015-07-13 14:29:22
此图一看就是电脑的原因。电脑的性能和配置跟不上。直接换电脑或升级电脑。

你怎么看出是电脑有问题，电脑上只是安装了软件
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闲暇时光
5楼2015-07-15 20:12:41
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
不行了，我我去吃点东西了，明天再谈，

你可以@凌波丽，我们继续讨论。
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7楼2015-07-16 14:13:05
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

2.对称性差，肩缝好像不明显。
（1）提高装柱的质量，使得色谱柱介质均匀。装入层析柱的介质要一次性全部装完，太松会引起拖尾峰，太紧会引起前延峰。
（2）样品与凝胶柱的介质存在非特性地吸附，所以应该改变和选择合适的流动相。
（3）层析柱介质以前使用后没有清洁，有不少杂质附着，应再生色谱柱。可以用0.2mol/LNaOH或者1mol/L NaCl 洗去杂质，再用双蒸馏水平衡，就在原层析柱上原位操作，在分离样品之前进行。
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小枯草
8楼2015-07-16 19:15:55
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小枯草

铜虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by 凌波丽 at 2015-07-16 19:15:55
2.对称性差，肩缝好像不明显。
（1）提高装柱的质量，使得色谱柱介质均匀。装入层析柱的介质要一次性全部装完，太松会引起拖尾峰，太紧会引起前延峰。
（2）样品与凝胶柱的介质存在非特性地吸附，所以应该改变和选 ...

谢谢高手，我每次跑出来的峰对称性都很差，前半个峰挺好，后半个峰就那副样子。貌似每次一次性装不完，每次都沉一点，加一点，用玻璃棒搅匀。
上样体积每次都达到要求了；
我的样品是水溶性的应该粘度不大吧；
调节洗脱液的离子强度和亲水性这个方法，有没有具体的案例可以参考？
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闲暇时光
9楼2015-07-16 21:21:07
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 小枯草 at 2015-07-16 21:21:07
谢谢高手，我每次跑出来的峰对称性都很差，前半个峰挺好，后半个峰就那副样子。貌似每次一次性装不完，每次都沉一点，加一点，用玻璃棒搅匀。
上样体积每次都达到要求了；
我的样品是水溶性的应该粘度不大吧；
...

一般蛋白质层析都不用纯水作流动相，而是用缓冲溶液作为流动相。

1.MMB11-Practical Protein Chromatography(1992)with contents   http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6382285

2.Guide to Protein Purification(2nd edition)METHODS IN ENZYMOLOGY Vol-463
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6382232

参考一下吧。
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10楼2015-07-16 21:33:58
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