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慕千雪

新虫 (初入文坛)

[求助] WB图老是跑不出来,条带一次比一次差肿么办? 已有3人参与

各位大神,小女子WB新手,做加药不同浓度后,对蛋白的影响,挑选了Bcl-2作为研究对象,
第一次做的时候,Bcl-2条带如图1,第二次如图2;第三次如图3;第四次如图4。——条带从最左边起往右数4个,对应加药浓度依次增加。
几次操作几乎没变化,第一次做配的一抗,二抗几天前配的,之后用的都是回收的一抗、二抗。12%的胶是买的。
疑惑的是,为啥第一次跑出条带,第二、三、四次都重复不出来呢?就算蛋白没有变化,可是条带不清晰是什么鬼啊???
最近流年不利,做什么实验都做不出结果,每次面对老板都无地自容了,求版上大神帮忙解惑
新虫一只,木有多少金币,见谅

WB图老是跑不出来,条带一次比一次差肿么办?
IMG_20150619_212025.jpg
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绯红誓言

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
菇凉,我对Bcl-2药代不是很了解,不过从你的实验经过上,我发现几个问题,值得你改变一下:
(吐槽一下:你一抗,二抗回收他们干嘛?还反复用,真是抠门的。)
1.你每反应一次他们就结合到你的膜上一些,那么你回收的一抗二抗就越少。从结果来看第一次结合了相当大一部分一抗,后面反应时一抗不足,因此不管你怎么加大给药浓度什么的,没有足够的一抗结合药物和二抗,自然越来越弱,这是一个层递关系。
2.一抗二抗不管你是用什么方法回收的,都存在污染长菌问题,因此会造成膜上斑斑点点,背景等问题。
建议:一抗、二抗按照你第一次的浓度,计算好每次用量不浪费,每次现配现用。
2楼2015-06-23 23:15:40
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慕千雪

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 绯红誓言 at 2015-06-23 23:15:40
菇凉,我对Bcl-2药代不是很了解,不过从你的实验经过上,我发现几个问题,值得你改变一下:
(吐槽一下:你一抗,二抗回收他们干嘛?还反复用,真是抠门的。)
1.你每反应一次他们就结合到你的膜上一些,那么你回 ...

感谢你的回答~
不过,一抗很贵的呀~我们实验室都是回收使用的,之前师兄师姐用着也没问题。
也有考虑过一抗二抗的问题,所以第四次做完发现没出条带后,我重新洗膜,重配一抗二抗再次孵育了。bcl-2这条还是出不来,同时操作的另一个MMP2倒是有清晰一些(MMP2一抗也重配的),但变化也不大。
所以,感觉也不是抗体的原因呢,哎╮(╯▽╰)╭
3楼2015-06-24 20:58:28
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绯红誓言

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 慕千雪 at 2015-06-24 20:58:28
感谢你的回答~
不过,一抗很贵的呀~我们实验室都是回收使用的,之前师兄师姐用着也没问题。
也有考虑过一抗二抗的问题,所以第四次做完发现没出条带后,我重新洗膜,重配一抗二抗再次孵育了。bcl-2这条还是出不来 ...

如果你确定一抗二抗没问题的话!请问你这做的是用药物刺激细胞表达蛋白影响的,上样的应该是细胞裂解液吧?1~4次用的是同一批吗?
现在这个问题仅有可能是有实验条件发生改变造成结果不一致的,譬如换试剂了、蛋白降解了等。WB的重复性不至于你做的这么差。
4楼2015-06-24 23:03:01
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zhysyz2008

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你好,看了你的图,感觉可能是不应该用回收之后的一抗,正如2楼的说的,针对有些蛋白,就是不能用回收之后的,为了实验结果好,浪费点老板也理解。不过不知道你的别的条件有没有变。
5楼2015-07-25 20:26:36
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木格天窗

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我觉得有可能是蛋白降解了,最好一抗不要回收,即使回收使用也不要超过三次,还有你的转膜液是新配的吗?
明天的太阳又是新的
6楼2016-04-08 13:52:57
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