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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » WB无目的条带，actin是正常的。
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amido

金虫 (小有名气)

[求助] WB无目的条带，actin是正常的。 已有7人参与

我想要的目的蛋白是鸟氨酸脱羧酶（ODC，51 kDa，位于胞浆），我搜了相关文献，该蛋白做WB并没有对于还原或非还原，变性或非变性的特殊要求，其中有一篇的各方面操作写的非常详细，也没有考虑变性或者还原的问题。故，我的实验步骤都是很常规的方法。尝试了两家公司的一抗，两种细胞株HepG2和A549（说明书上条带很亮），上样量50ug。

我每次实验的结果都可以用下边的图来表示，即β-actin很清晰，几乎背景颜色，目的蛋白部位无任何条带。

第一家公司的一抗已经退货，第二家是Abcam的，已经交了投诉表。

提取蛋白：买的全蛋白提取试剂盒（含有裂解液，各种酶抑制剂等），按照说明书做的；
蛋白电泳：网上搜的最常规的配方（有SDS），步骤；
转膜：由Marker可以看出，非常清晰；
封闭：5% 脱脂奶粉，1h，室温；
一抗：兔源，5% 脱脂奶粉溶液，12h，4℃；
二抗：鼠抗兔，TBST溶液，1h，室温；
显影：ECL，天能的仪器，最大曝光5min。

综上，无目的条带的原因，除了一抗有问题，是否还有其他可以改进的地方？谢谢各位了，这实验我从5.1放假前的周末开始做，直到现在，尝试了各种条件。

WB无目的条带，actin是正常的。
WB图片-可见光下与ECL试剂显色后
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1楼 2015-06-12 16:29:30
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673643401

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
amido(youlinglyw代发): 金币+5, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩 2015-08-18 20:17:43
1.你的蛋白根本没有表达或表达的量很少，检测不到。
2.你的蛋白量太少，转膜没转上，建议100V，100min。（这个条件我易反复试过很多次，没问题）
3.转膜后用丽春红染色看一下是否有蛋白，如果没有你就不需要进行下面的步骤了。（有些时候，蛋白量很少 丽春红染色也显示不出来，这个方法就不适用）
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9楼2015-08-03 12:53:55
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查看全部 13 个回答

董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amido: 金币+20, ★★★很有帮助, 你好，该蛋白在肿瘤细胞是过表达的，我先做的HepG2，后来做A549（说明书上这种细胞条带最亮）。至于您说的不做封闭，我会尝试下的，谢谢！ 2015-06-12 17:11:32
有没有考虑细胞的问题？多做几个细胞试试，再不行，不做封闭那步试试吧
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医学&统计学
2楼2015-06-12 16:58:22
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毛线线爱科研

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amido: 金币+20, ★★★很有帮助, 你好，我的一抗浓度很高，稀释倍数说明书上建议量1/1000~1/10000，我按1/1000做的。至于曝光时间，我尝试过，时间太长就变淡了，目前最长试过刚加完ECL，曝光5min。我没用过暗室和胶片，是否用了暗室和胶片曝光可以大大延长？ 2015-06-12 22:26:38
你可以尝试增加曝光时间，或者减少抗体稀释倍数，有可能这种蛋白含量较少，不好检测。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2015-06-12 22:17:14
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amido

金虫 (小有名气)
wizardfan: 回帖置顶 2015-07-31 09:06:44
原帖无法再编辑，这里补充下。我的目的蛋白的膜非常干净，一方面原因是抗体完全没效果，另一原因，是没有相关蛋白。
转膜：我用的是60V, 2h，没有注意电流是多少。请教同学后说有可能转膜转过了，我明天打算尝试恒流250mV，50min。
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4楼2015-06-12 22:57:20
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