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WB无目的条带，actin是正常的。 已有7人参与
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我想要的目的蛋白是鸟氨酸脱羧酶（ODC，51 kDa，位于胞浆），我搜了相关文献，该蛋白做WB并没有对于还原或非还原，变性或非变性的特殊要求，其中有一篇的各方面操作写的非常详细，也没有考虑变性或者还原的问题。故，我的实验步骤都是很常规的方法。尝试了两家公司的一抗，两种细胞株HepG2和A549（说明书上条带很亮），上样量50ug。 我每次实验的结果都可以用下边的图来表示，即β-actin很清晰，几乎背景颜色，目的蛋白部位无任何条带。 第一家公司的一抗已经退货，第二家是Abcam的，已经交了投诉表。 提取蛋白：买的全蛋白提取试剂盒（含有裂解液，各种酶抑制剂等），按照说明书做的； 蛋白电泳：网上搜的最常规的配方（有SDS），步骤； 转膜：由Marker可以看出，非常清晰； 封闭：5% 脱脂奶粉，1h，室温； 一抗：兔源，5% 脱脂奶粉溶液，12h，4℃； 二抗：鼠抗兔，TBST溶液，1h，室温； 显影：ECL，天能的仪器，最大曝光5min。 综上，无目的条带的原因，除了一抗有问题，是否还有其他可以改进的地方？谢谢各位了，这实验我从5.1放假前的周末开始做，直到现在，尝试了各种条件  。 WB图片-可见光下与ECL试剂显色后 |
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huiting410
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7楼2015-07-31 05:51:36
董博士
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2楼2015-06-12 16:58:22
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
amido: 金币+20, ★★★很有帮助, 你好，我的一抗浓度很高，稀释倍数说明书上建议量1/1000~1/10000，我按1/1000做的。至于曝光时间，我尝试过，时间太长就变淡了，目前最长试过刚加完ECL，曝光5min。我没用过暗室和胶片，是否用了暗室和胶片曝光可以大大延长？ 2015-06-12 22:26:38
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amido: 金币+20, ★★★很有帮助, 你好，我的一抗浓度很高，稀释倍数说明书上建议量1/1000~1/10000，我按1/1000做的。至于曝光时间，我尝试过，时间太长就变淡了，目前最长试过刚加完ECL，曝光5min。我没用过暗室和胶片，是否用了暗室和胶片曝光可以大大延长？ 2015-06-12 22:26:38
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你可以尝试增加曝光时间，或者减少抗体稀释倍数，有可能这种蛋白含量较少，不好检测。 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
3楼2015-06-12 22:17:14
4楼2015-06-12 22:57:20
