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drh34

铜虫 (小有名气)

[求助] BiFC只能验证蛋白的直接互作吗 已有2人参与

BiFC实验结果两个蛋白有互作,但酵母双杂交不互作,求解!?
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

我今天终于理解了 在米国的师姐 (在小木虫的ID:凌波丽)为什么说踏上小木虫论坛会经常感到愤怒,当然我的专业本事和脾气都比 凌波丽 要小得多。。。。。。
6楼2015-06-12 16:19:30
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查看全部 7 个回答

starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-06-10 16:25:15
做蛋白相互作用有很多方法,任何一个都有其优点缺点,同时也可能造成假阳性或无法测到某些相互作用,BiFC实际上反应了生理条件下一对蛋白能否接近到很近的状态,由此验证是否有相互作用存在。楼主的问题给出信息偏少,不好判断。可能是BiFC结果有问题,实际上不存在相互作用,也可能是酵母那边蛋白表达或构象不正确,无法测出相互作用,这种情况下需要一方面分析实验看看有没有问题,另一方面是换用别的方法譬如pull down。
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
2楼2015-06-10 15:52:37
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MrFat

铁虫 (初入文坛)

BiFC不能说明是两个蛋白直接互作吧?而是说明两个蛋白在体内互作~直接互作最好是纯化蛋白,做体外pull-down~
酵母和BiFC用的不是一样的体系~BiFC一般是植物或动物的生理体系~有可能这两个蛋白互作需要某种特定的生理环境或者生理因子,酵母中没有~
最好是有图比较好确认~而且BiFC是否做了负对照?

同楼上,应该用别的方法在进行验证,例如co-IP实验~
3楼2015-06-10 19:08:59
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
BiFC阳性能够说明说明是两个蛋白直接互作!
双分子荧光互补技术BiFC(Bimolecular Fluorescence Complementation)
是将荧光报告蛋白按照规则分成没有荧光的两段,分别与诱饵蛋白和捕获蛋白融合,只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下,两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白,发出荧光。活细胞收集后,在流式细胞仪中的检测是实时进行的,只要细胞中有荧光产生就会被捕捉到信号,因此,不论是亲和力较弱的结合还是暂时性的结合都不会被遗漏。
这是一种比较新型的蛋白质相互作用检测技术,理论上讲,可能在一些时候可以比酵母双杂交更灵敏,但是无论是双分子荧光还是酵母双杂交,都涉及到一个融合蛋白的构像改变的问题,如果与荧光报道基因的两个分割部分或者转录因子的两个分割部分中两者或者另种实验方法中的报告蛋白质的两部分任何之一发生剧烈的构想变化,那么可能能够相互作用的被检测的两种蛋白质的标记者却无法形成有功能的报告蛋白质结构,那么实验结果就无法显示出阳性。而蛋白质的折叠是一种很复杂的过程,没有任何一种理论能够概括出所有已知的蛋白质的折叠过程和折叠结果,而且有些蛋白质也不是只有一种折叠路径,甚至不止一种稳定的折叠结果。
所以楼主因该多用一些蛋白质相互作用的研究方法,具体研究方法请见:
Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions,Humana Press,2004(唯一完整版)
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7764403
此书是我在米国的师姐发的。
4楼2015-06-12 15:53:25
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