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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 酵母做电转时点转杯大小有关系吗
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小橘子2013

新虫 (小有名气)

[求助] 酵母做电转时点转杯大小有关系吗 已有1人参与

最近在做酵母电转化，实验室只有0.4mm点转杯，想问一下需要用多少感受态和线性化后的质粒呢？
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简简单单才是真
1楼 2015-06-08 16:33:14
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
我们一般用0.2的或者0.1的，理论上大点影响也不是很多。

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2楼2015-06-08 19:15:19
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小橘子2013

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guoqin_shiyin at 2015-06-08 19:15:19
我们一般用0.2的或者0.1的，理论上大点影响也不是很多。

我是想问 每个大小的杯子都有自己的容量吧  电转的话是都要装满吗  如果感受态和质粒不够的话  需要用什么补齐吗  山梨醇可以吗
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简简单单才是真
3楼2015-06-08 21:09:58
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小橘子2013 at 2015-06-08 21:09:58
我是想问 每个大小的杯子都有自己的容量吧  电转的话是都要装满吗  如果感受态和质粒不够的话  需要用什么补齐吗  山梨醇可以吗...

一般我们不会装满，装200微升就够了。。。。没必要装满，至于质粒，一般体积控制在5微升和酵母混合。。。感受态细胞多少其实不太重要，多点也没关系。酵母很好转

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4楼2015-06-08 21:17:52
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 0.4mm杯子在相同条件下提供的场强比0.2mm的低一些，更适合大一些的哺乳细胞的转化，酵母也能转，但是不一定能达到满板转化子的效果。如果后期有筛多拷贝要求的话，最好提高电压或者换0.2mm的杯子。
2.感受态按现成的protocol来做，只要保证初始扩培的时候酵母OD在1.0—1.2这个菌体浓度，后期不需要太过关注感受态浓度。
3.DNA最好在5ug—10ug这个程度。体积10ul左右添加到100ul左右感受态里直接加到电极杯中就可以转化了。
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大家相互帮助哈
5楼2015-06-09 00:27:43
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小橘子2013

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-09 00:27:43
1. 0.4mm杯子在相同条件下提供的场强比0.2mm的低一些，更适合大一些的哺乳细胞的转化，酵母也能转，但是不一定能达到满板转化子的效果。如果后期有筛多拷贝要求的话，最好提高电压或者换0.2mm的杯子。
2.感受态按现 ...

如果我用0.4mm的电转杯的话，直接加100ul感受态和10ul质粒的话就可以直接转了吗？会不会太少啊？我要是用2kv-2.5kv的电压会有电火花的呢  有影响吗？
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简简单单才是真
6楼2015-06-09 16:06:57
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小橘子2013

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by guoqin_shiyin at 2015-06-08 21:17:52
一般我们不会装满，装200微升就够了。。。。没必要装满，至于质粒，一般体积控制在5微升和酵母混合。。。感受态细胞多少其实不太重要，多点也没关系。酵母很好转
...

不装满的话会有电火花的，对酵母和电转杯有影响吗？
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简简单单才是真
7楼2015-06-09 16:08:07
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 小橘子2013 at 2015-06-09 16:06:57
如果我用0.4mm的电转杯的话，直接加100ul感受态和10ul质粒的话就可以直接转了吗？会不会太少啊？我要是用2kv-2.5kv的电压会有电火花的呢  有影响吗？...

电火花出现在杯口还是杯内？你的电转参数是如何设置的？你的DNA和感受太是如何制备的？

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大家相互帮助哈
8楼2015-06-09 18:01:15
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-09 18:01:15
电火花出现在杯口还是杯内？你的电转参数是如何设置的？你的DNA和感受太是如何制备的？
...

装100太少了，有电火花是因为你洗得不纯。。。适当增加感受态，话说干嘛用0.4的？买几个0.2的好了，反正可以重复用

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9楼2015-06-09 20:27:38
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小橘子2013 at 2015-06-09 16:08:07
不装满的话会有电火花的，对酵母和电转杯有影响吗？...

不能装满，因为你电了下后要加入1毫升培养基的

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10楼2015-06-09 20:28:44
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