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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 酵母做电转时点转杯大小有关系吗
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小橘子2013

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by guoqin_shiyin at 2015-06-09 20:28:44
不能装满，因为你电了下后要加入1毫升培养基的
...

我说的装满是两个银色电极之间 大约800ul  不是装到杯口   电火花是因为什么没洗干净啊？屋里只有0.4mm的 好像还有个0.1mm的 不知道能不能用呢还      老师嘛肯定是用现有的 不可能给买别的东西 唉
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简简单单才是真
11楼2015-06-10 15:42:23
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小橘子2013

新虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-09 18:01:15
电火花出现在杯口还是杯内？你的电转参数是如何设置的？你的DNA和感受太是如何制备的？
...

参数是2KV，200Ω，25uf，5s

dna是酶切三小时后用乙醇沉淀的

酵母感受态就是最普通的制备方法 OD600=1.0  收集后水洗两次  山梨醇洗一次 1ml山梨醇重悬 80ul每管分装的
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简简单单才是真
12楼2015-06-10 15:46:14
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
小橘子2013: 金币+6, ★★★★★最佳答案 2015-06-11 15:53:27
引用回帖:
12楼: Originally posted by 小橘子2013 at 2015-06-10 15:46:14
参数是2KV，200Ω，25uf，5s

dna是酶切三小时后用乙醇沉淀的

酵母感受态就是最普通的制备方法 OD600=1.0  收集后水洗两次  山梨醇洗一次 1ml山梨醇重悬 80ul每管分装的...

你放电时间有5秒钟？而不是5ms？
如果放电时间确实是5s，那你出现电火花的原因不是由于酵母细胞和DNA预处理不干净使得离子浓度过大导致的短路放电。而是你加样过少导致的电极杯两端平行板根本没有连通导致的电阻过大，平行板两端长时间维持2000v左右的高电压直到电弧产生电荷转移。最简单的处理办法就是多加样，让电路连通，放电时间自然会回到正常范围内。
1. 4mm杯子容量比较大，至少在2ml以上，电场强度相对较低。LZ多加样的思路是对的，也不需要太多，400ul足以让电路连通，2Kv够用了，电击后1M山梨醇添加量1ml——2ml都可以。
2.  1mm的杯子同样电压下提供的场强非常强，所以如果换用1mm的杯子，按照LZ你原来的80ul完全可以连通电路，电压在800v——1500v之间，其与参数维持不变。
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大家相互帮助哈
13楼2015-06-11 02:10:21
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小橘子2013

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-11 02:10:21
你放电时间有5秒钟？而不是5ms？
如果放电时间确实是5s，那你出现电火花的原因不是由于酵母细胞和DNA预处理不干净使得离子浓度过大导致的短路放电。而是你加样过少导致的电极杯两端平行板根本没有连通导致的电阻过 ...

好的 受教了 谢谢你的帮助   
现在还有一个问题，就是酵母诱导表达的时候用BMGY长到OD600=2-6，收集菌体再用一定BMMY重悬使其OD600=1.从这时开始计算每24H添加一次甲醇是吧？刚换完培养基是不能加甲醇是是吗？
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简简单单才是真
14楼2015-06-11 15:53:01
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 小橘子2013 at 2015-06-11 15:53:01
好的 受教了 谢谢你的帮助   
现在还有一个问题，就是酵母诱导表达的时候用BMGY长到OD600=2-6，收集菌体再用一定BMMY重悬使其OD600=1.从这时开始计算每24H添加一次甲醇是吧？刚换完培养基是不能加甲醇是是吗？...

换培养基的时候就加上甲醇。
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15楼2015-06-11 22:12:00
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小橘子2013

新虫 (小有名气)
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15楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-11 22:12:00
换培养基的时候就加上甲醇。...

那我有个未诱导的对照应该用什么补齐呢？
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简简单单才是真
16楼2015-06-12 08:25:44
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小橘子2013

新虫 (小有名气)
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15楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-11 22:12:00
换培养基的时候就加上甲醇。...

还想就是用补齐甲醇的BMMY培养基来调PH值呢  还是调好PH值后再按1%加甲醇呢？
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简简单单才是真
17楼2015-06-12 08:28:14
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小橘子2013

新虫 (小有名气)
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17楼: Originally posted by 小橘子2013 at 2015-06-12 08:28:14
还想就是用补齐甲醇的BMMY培养基来调PH值呢  还是调好PH值后再按1%加甲醇呢？...

我的意思是 如果我想用100%甲醇去诱导每次就加几毫升，而原来的用10X甘油的时候是加十倍的量   对整体的体积和浓度会有影响吧  还是把甲醇也配成10%每次加1%这样应该对培养基的浓度不会有影响了吧
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简简单单才是真
18楼2015-06-12 08:56:39
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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17楼: Originally posted by 小橘子2013 at 2015-06-12 08:28:14
还想就是用补齐甲醇的BMMY培养基来调PH值呢  还是调好PH值后再按1%加甲醇呢？...

BMMY里面的pH6.0的磷酸钾就是提供缓冲作用的，不需要额外调pH的。
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19楼2015-06-12 14:54:57
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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18楼: Originally posted by 小橘子2013 at 2015-06-12 08:56:39
我的意思是 如果我想用100%甲醇去诱导每次就加几毫升，而原来的用10X甘油的时候是加十倍的量   对整体的体积和浓度会有影响吧  还是把甲醇也配成10%每次加1%这样应该对培养基的浓度不会有影响了吧...

甲醇母液浓度较低会让培养基体积升高，但是只要提前算好增加的体积以及与其相匹配的甲醇添加量，添加甲醇的终浓度一致就可以，对培养基影响并不是很大。
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20楼2015-06-12 14:57:44
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