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缘来是伊木虫 (小有名气)
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[交流]
谁有做电转化时E.coli感受态细胞的制备的操作步骤的资料？求分享，谢谢！
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| 由于电转化效率比较高，我的质粒比较大，想用电转化，谁有做电转化时E.coli感受态细胞的制备的操作步骤的资料？求分享，谢谢！ |
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缘来是伊
木虫 (小有名气)
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- 专业: 环境微生物学
送红花一朵 4楼2015-05-15 17:37:13
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌 大肠杆菌E.coli DH5a感受态细胞的制备参照《分子克隆实验指南》的方法进行 1. 缓冲液和溶液： ①CaCl2 •2H2O（1mol/L） 注：制备感受态细胞时，取出10ml贮存液加90ml纯水稀释至100ml，用预处理的Nalgene 滤膜（0.45um孔径）过滤除菌，放置冰上。 ② CaCl2-MgCl2溶液冰上预冷 2. 培养基 ①LB 液体LB培养基的配方如下: 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L；酵母提取物(Yeast extract) 5g/L；氯化钠(NaCl) 10g/L 摇动容器直至溶质溶解（或加热搅拌）.用5mol/L NaOH(约0.2ml)调节该培养基的pH,使其达到7.0(该pH适合目前使用最广的原核表达菌种E.coli的生长)，在15psi（1.05Kg/cm2=103kPa）,121.3℃蒸汽灭菌20min。 固体加15g琼脂粉（若不易溶解时，不断加热搅拌） 抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置于55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 ②SOC 除加入20mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同。SOB培养基经过高压灭菌后冷却至60℃或60℃以下，加20mL除菌的1mol/L葡萄糖溶液（1mol/L葡萄糖溶液的配制方法是：用90mL去离子水溶解18g葡萄糖，完全溶解后，用去离子水（蒸馏水）定容至100ml,用0.22um氯气过滤除菌）。 SOB培养基：配制每升培养基，在950ml去离子水（蒸馏水）中加入：胰化蛋白胨 20g，酵母提取物5g，NaCl 0.5g 摇动溶液是溶质完全溶解。加10ml 250mmol/L KCl溶液（将1.86gKCl用100mL去离子水溶解即配成250mmol/L的KCl溶液）。用5mol/L NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.0。用去离子水定容至1L。在15psi高压下蒸汽灭菌20min。该溶液在使用前，加入5mL灭菌的2mol/L的MgCl2(90ml去离子水溶解19g MgCl2，用去离子水调整体积为100ml，在15psi高压下整齐灭菌20min) 3.实验过程 A：用接种环取少量细菌保存液接种，37℃培养16-20h B：取大肠杆菌DH5a单菌落，接种于5mL液体LB培养基中，于37℃振荡培养过夜 C：取0.5mL上述过夜培养物，按1：100的稀释比例倒入20mL LB液体培养基中37℃振荡培养3-4h。 注：为达到高的转化效率，活细胞数目务必小于108个/L，对大多数大肠杆菌来说，这相当于OD600值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20min测定OD600来监控，用监控的时间及OD600值列一个图表，以便预测培养物的OD600值达到0.4的时间，当OD值达到0.35时，收获细菌培养物。 不同菌株的OD值与活菌数关系差异很大，因此有必要测定所用菌株的对应关系。以LB琼脂平板计算每一时刻的细菌活菌数，从而是分光光度计的读数标准化。 D：将培养液转移到预冷的50mL无菌离心管中，冰浴30min，使菌液冷却至0℃，于4℃4000r／min离心10min，弃上清液（培养液倒出后，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽） D：每50ml初始培养液用30ml预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液（80mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2），即每支离心管沉淀中加入30mL冰浴的CaCl2-MgCl2溶液，重悬每份细胞沉淀。 E：于4℃ 4100r／min离心10min，弃上清液（培养液倒出后，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽）以回收细胞 F：每50ml初始培养液用2ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬每份细胞沉淀即每支离心管沉淀中加入2mL冰浴的CaCl2溶液。 G：分装后于液氮中迅速冷冻，置-70℃冰箱中，长期保存，也可立即使用 |
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3楼2015-05-15 09:58:46
xiaochong8693
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8楼2015-05-17 22:08:32
