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DB3.1高效感受态细胞制备问题 已有2人参与
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虫友们： 有谁在做感受态制备呀？最近遇到一个棘手问题，我本站http://muchong.com/html/200607/277251.html查到高效感受态细胞制备方法，其上说：100ml培养基...........培养的菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。 请问有人这么加了DMSO 吗？还是大家都是加文中说的：用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟， 谁能告诉我到底加多少DMSO合适？ |
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Neo2000
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2楼2014-06-21 18:44:13
【答案】应助回帖
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制备感受态细胞 准备Inous转化缓冲液（用前冰上预冷至0℃） 0.5mol/L的PIPES（pH 6.7）溶液的配制：将15.1g PIPES溶于80ml水中（Milli-Q级或与之相当），用5mol/L KOH调pH至6.7，最后加纯水，定容至100ml。用预先处理的Nalgene滤膜（0.45𝜇m）过滤除菌。分成小份于 -20℃保存。 Inoue转化缓冲液的配制：将下列组分溶于800ml纯水中，然后加20ml 0.5mol/L的PIPES，加纯水定容至1L。 试剂 需要量/L 终浓度 MnCl_2•4H_2O 10.88g 55mmol/L CaCl_2•2H_2O 2.20g 15mmol/L KCl 18.65g 250mmol/L PIPES（0.5mol/L,pH6.7） 20ml 10mmol/L H_2O 定容至1L C． 用预先处理的Nalgene滤膜（0.45𝜇m）过滤除菌。分成小份于 -20℃保存。 2． 挑取一个经37℃培养16～20h 平板上的单菌落（2～3mm直径），接种至250ml锥形瓶中的25ml LB或SOB培养液中37℃摇床（250～300rpm）培养6～8h。 3. 晚上约6点钟，将上述初始培养物接种于三个盛有250ml SOB培养液的1L锥形瓶中，第一个加10ml，第二个加4ml，第三个加2ml，于18～22℃中摇床过夜。 4. 次日早上，测量三瓶培养物的OD_600值，每45min测定一次。 5. 当有一瓶培养物OD_600=0.55时，将培养物至于冰上10min，弃去另两瓶培养物。 6. 于4℃以2500g离心10min，收集菌体。 7. 倒去培养基，将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干生剩余液体，并将贴附在壁上的培养基吸干。 8. 加80ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬细菌沉淀。（轻轻旋转，不要震荡或吹吸混匀） 9. 于4℃ 2500g离心10min收集菌体。 10. 倒去上层缓冲液，将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干剩余液体，并将壁上缓冲液吸干。 冻存感受态细胞 11. 用20ml预冷的Inoue转化缓冲液轻轻重悬沉淀。 12. 加1.5ml DMSO，轻轻混匀细菌悬液，冰上放置10min。 13. 迅速将悬液分装到冷却的无菌Ep管中，封紧管口，投入液氮中快速冻存感受态细胞。贮存于 -70℃备用。 |
3楼2014-06-23 19:18:55
4楼2014-06-24 12:01:28
5楼2017-08-11 10:48:06