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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » DB3.1高效感受态细胞制备问题
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liangny

新虫 (初入文坛)

[求助] DB3.1高效感受态细胞制备问题 已有2人参与

虫友们：
有谁在做感受态制备呀？最近遇到一个棘手问题，我本站http://muchong.com/html/200607/277251.html查到高效感受态细胞制备方法，其上说：100ml培养基...........培养的菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。
请问有人这么加了DMSO 吗？还是大家都是加文中说的：用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟，
谁能告诉我到底加多少DMSO合适？
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liangny

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1楼 2014-06-21 17:15:21
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liangny(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-21 19:07:07
还是经典的氯化钙法简单易用，想要高效率建议电转化

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-06-21 18:44:13
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tiny_C

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-06-24 12:08:40
制备感受态细胞
        准备Inous转化缓冲液（用前冰上预冷至0℃）
        0.5mol/L的PIPES（pH 6.7）溶液的配制：将15.1g PIPES溶于80ml水中（Milli-Q级或与之相当），用5mol/L KOH调pH至6.7，最后加纯水，定容至100ml。用预先处理的Nalgene滤膜（0.45𝜇m）过滤除菌。分成小份于 -20℃保存。
        Inoue转化缓冲液的配制：将下列组分溶于800ml纯水中，然后加20ml 0.5mol/L的PIPES，加纯水定容至1L。
试剂        需要量/L        终浓度
MnCl_2•4H_2O        10.88g        55mmol/L
CaCl_2•2H_2O        2.20g        15mmol/L
KCl        18.65g        250mmol/L
PIPES（0.5mol/L,pH6.7）        20ml        10mmol/L
H_2O        定容至1L       
C． 用预先处理的Nalgene滤膜（0.45𝜇m）过滤除菌。分成小份于 -20℃保存。
2． 挑取一个经37℃培养16～20h 平板上的单菌落（2～3mm直径），接种至250ml锥形瓶中的25ml LB或SOB培养液中37℃摇床（250～300rpm）培养6～8h。
3. 晚上约6点钟，将上述初始培养物接种于三个盛有250ml SOB培养液的1L锥形瓶中，第一个加10ml，第二个加4ml，第三个加2ml，于18～22℃中摇床过夜。
4. 次日早上，测量三瓶培养物的OD_600值，每45min测定一次。
5. 当有一瓶培养物OD_600=0.55时，将培养物至于冰上10min，弃去另两瓶培养物。
6. 于4℃以2500g离心10min，收集菌体。
7. 倒去培养基，将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干生剩余液体，并将贴附在壁上的培养基吸干。
8. 加80ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬细菌沉淀。（轻轻旋转，不要震荡或吹吸混匀）
9. 于4℃ 2500g离心10min收集菌体。
10. 倒去上层缓冲液，将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干剩余液体，并将壁上缓冲液吸干。

冻存感受态细胞
11. 用20ml预冷的Inoue转化缓冲液轻轻重悬沉淀。
12. 加1.5ml DMSO，轻轻混匀细菌悬液，冰上放置10min。
13. 迅速将悬液分装到冷却的无菌Ep管中，封紧管口，投入液氮中快速冻存感受态细胞。贮存于 -70℃备用。
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3楼2014-06-23 19:18:55
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liangny

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
非常感谢楼上的回复，送花一朵
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4楼2014-06-24 12:01:28
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大别克

新虫 (初入文坛)
DB3.1使用经典氯化钙甘油法足够，简单实用方便，效价完全能够满足。
这个280ml应该是写错了，280ul，DMSO终浓度7%就可以的
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5楼2017-08-11 10:48:06
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