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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急切求助感受态制备的问题，请高手指导
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王玉民

新虫 (小有名气)

[求助] 急切求助感受态制备的问题，请高手指导

这天制备的农杆菌和大肠杆菌感受态都没结果，郁闷死了，请高手指导，下面说我做的过程。
农杆菌的制备与转化：
菌株：EHA105
过程：
   1.用挑取单菌落接种到含有50μg/ml利福平的YEB液体培养基中，28℃,200rpm振荡培养约17h。
3、将培养活化的农杆菌按1:50的比例稀释到50 ml含有50 μg/ml利福平的YEB培养基中，28℃振荡培养到OD600约0.6。
4. 将上述培养液转入灭过菌的50ml离心管中，冰浴30 min。
5、于4℃，5000 r/min离心10 min，弃上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2悬浮菌体。
6、于4℃，5000 r/min离心10 min，弃上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2悬浮菌体。
7、每管200 μl分装，液氮速冻，－70℃保存。
8.  加入4μl质粒（约1μg）质粒，轻轻混匀，冰浴30 min。
3、置液氮中冰冻5min，迅速移入37℃水浴中温浴5 min，再迅速冰浴2 min，之后加入500 μl液体YEB培养基，于28℃，,200rpm振荡培养5h。
4、充分活化后的混合物4℃ 5000rpm离心2min，沉淀菌体，弃去上清。
5.用新的YEB培养基重新悬浮菌体后，均匀涂布于含有50mg/l的利福平和75mg/l的SPC(载体抗性）固体培养基上，28度倒置培养24-48h。
大肠杆菌的制备与转化
1.挑单菌落接种于4ml LB 液体培养基（不含抗生素），于 37℃、250rpm 振荡培养过夜（约12小时左右）；
2. 取 1ml 过夜培养物按 1::50的稀释比例转接于50ml LB 液体培养基中，37℃振荡培养 4 小时，待细菌达到对数生长期（OD600为 0.5~0.6）；
3. 将培养液转移到两只预冷的 50ml 无菌离心管中，置冰上 10 分钟，使菌液冷却到0℃。于 4℃、5000rpm 离心 10 分钟，弃上清；
4.每只离心管加入 10ml 冰冷的 0.1 mol /l无菌 CaCl2将菌体重悬，冰浴放置 10 分钟，于 4℃、5000rpm 离心 510分钟，去上清；
5.每只离心管各加入 2ml 冰冷的 0.1 mol/l CaCl2重悬沉淀。
6.液氮速冻 置-70℃保存备用。
7.PUC19转化无结果。
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心晴
1楼2011-11-18 08:53:16
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2, MolEPI+1): 鼓励积极应助！ 2011-11-18 18:33:00
我只制备过大肠杆菌的感受态，楼主的步骤大的方向是这样的，但是小细节方面不知道注意没有：
1、楼主按1:50的比例稀释，而且培养了4h，这个时间是不是有点长了；之前我的比例是1:100的比例，培养的时间为2.5-3h，而且摇好后可立即放到冰上
2、感受态的制备过程均是在冰上操作的，楼主只洗了1次，我一般洗2两次，第一次10-15ml，第二次6ml，100mM的氯化钙，
3、最后每管悬浮于1ml的氯化钙中，分装之前先将离心管预冷一下，再进行分装。
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2楼2011-11-18 09:15:52
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-11-18 18:33:14
一般情况下，制作感受态细胞的方法都是现成的，只是略微改改而已，不过基本对感受态的效率和活性没有太大影响；
关键还是操作问题，整个操作过程速度快，注意低温，做完之后立马冻存！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2011-11-18 10:27:04
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3, MolEPI+1): Good!鼓励分享!对楼主有帮助! 2011-11-19 18:44:24
一般的做法，转化后都会有个复苏过程，农杆菌这个可以加800uL YEB（无抗）培养基在1.5mL EP管里摇4-6个小时再涂板；大肠杆菌这个也可以复苏45分钟以后再涂板，可以一定程度提升转化率。
此外，我们的大肠杆菌对数期标准为OD550或者600等于0.4，不要超过这个数值，不然氯化钙法的转化率降低很多。氯化钙尽量使用含有结晶水的晶体新鲜配制，市售的无水氯化钙往往不是很纯。
收获菌体的那一步，降温要均匀迅速，我们一般在制冰机里摇震3角瓶。
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How about the future？
4楼2011-11-19 16:32:39
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