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急切求助感受态制备的问题，请高手指导
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这天制备的农杆菌和大肠杆菌感受态都没结果，郁闷死了，请高手指导，下面说我做的过程。 农杆菌的制备与转化： 菌株：EHA105 过程： 1.用挑取单菌落接种到含有50μg/ml利福平的YEB液体培养基中，28℃,200rpm振荡培养约17h。 3、将培养活化的农杆菌按1:50的比例稀释到50 ml含有50 μg/ml利福平的YEB培养基中，28℃振荡培养到OD600约0.6。 4. 将上述培养液转入灭过菌的50ml离心管中，冰浴30 min。 5、于4℃，5000 r/min离心10 min，弃上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2悬浮菌体。 6、于4℃，5000 r/min离心10 min，弃上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2悬浮菌体。 7、每管200 μl分装，液氮速冻，－70℃保存。 8. 加入4μl质粒（约1μg）质粒，轻轻混匀，冰浴30 min。 3、置液氮中冰冻5min，迅速移入37℃水浴中温浴5 min，再迅速冰浴2 min，之后加入500 μl液体YEB培养基，于28℃，,200rpm振荡培养5h。 4、充分活化后的混合物4℃ 5000rpm离心2min，沉淀菌体，弃去上清。 5.用新的YEB培养基重新悬浮菌体后，均匀涂布于含有50mg/l的利福平和75mg/l的SPC(载体抗性）固体培养基上，28度倒置培养24-48h。 大肠杆菌的制备与转化 1.挑单菌落接种于4ml LB 液体培养基（不含抗生素），于 37℃、250rpm 振荡培养过夜（约12小时左右）； 2. 取 1ml 过夜培养物按 1::50的稀释比例转接于50ml LB 液体培养基中，37℃振荡培养 4 小时，待细菌达到对数生长期（OD600为 0.5~0.6）； 3. 将培养液转移到两只预冷的 50ml 无菌离心管中，置冰上 10 分钟，使菌液冷却到0℃。于 4℃、5000rpm 离心 10 分钟，弃上清； 4.每只离心管加入 10ml 冰冷的 0.1 mol /l无菌 CaCl2将菌体重悬，冰浴放置 10 分钟，于 4℃、5000rpm 离心 510分钟，去上清； 5.每只离心管各加入 2ml 冰冷的 0.1 mol/l CaCl2重悬沉淀。 6.液氮速冻 置-70℃保存备用。 7.PUC19转化无结果。 |
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 【分子生物】EPI帖 | 核酸方面 |
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yesucao
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【答案】应助回帖
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amisking(金币+2, MolEPI+1): 鼓励积极应助！ 2011-11-18 18:33:00
amisking(金币+2, MolEPI+1): 鼓励积极应助！ 2011-11-18 18:33:00
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我只制备过大肠杆菌的感受态，楼主的步骤大的方向是这样的，但是小细节方面不知道注意没有： 1、楼主按1:50的比例稀释，而且培养了4h，这个时间是不是有点长了；之前我的比例是1:100的比例，培养的时间为2.5-3h，而且摇好后可立即放到冰上 2、感受态的制备过程均是在冰上操作的，楼主只洗了1次，我一般洗2两次，第一次10-15ml，第二次6ml，100mM的氯化钙， 3、最后每管悬浮于1ml的氯化钙中，分装之前先将离心管预冷一下，再进行分装。 |
2楼2011-11-18 09:15:52
天使托
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3楼2011-11-18 10:27:04
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【答案】应助回帖
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wanhscn(金币+3, MolEPI+1): Good!鼓励分享!对楼主有帮助! 2011-11-19 18:44:24
wanhscn(金币+3, MolEPI+1): Good!鼓励分享!对楼主有帮助! 2011-11-19 18:44:24
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一般的做法，转化后都会有个复苏过程，农杆菌这个可以加800uL YEB（无抗）培养基在1.5mL EP管里摇4-6个小时再涂板；大肠杆菌这个也可以复苏45分钟以后再涂板，可以一定程度提升转化率。 此外，我们的大肠杆菌对数期标准为OD550或者600等于0.4，不要超过这个数值，不然氯化钙法的转化率降低很多。氯化钙尽量使用含有结晶水的晶体新鲜配制，市售的无水氯化钙往往不是很纯。 收获菌体的那一步，降温要均匀迅速，我们一般在制冰机里摇震3角瓶。 |
4楼2011-11-19 16:32:39
